Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Факторы патогенности микроорганизмов




Основными факторами патогенности являются многочисленные токсины и ферменты. Приводим некоторые методы определения этих патогенных факторов.

Токсины. Это активные в биологическом, антигенном, токсигенном и др. действиях факторы патогенности многих микроорганизмов. Токсины (греч. toxicon - яд) бывают двух типов: экзогенные (собственно токсины) и эндогенные.

1. Определение летального токсина.

а) Культуру, например, стафилококка штамма Кован засевают на чашку Петри с агаром, приготовленным по методу Париш и Кларка (агар, разведенный мартеновским бульоном поровну). Чашки помещают в эксикатор (с 20 % содержанием СО2), далее - в термостат на 24 ч при 370 С. После инкубации наливают еще 10 мл мартеновского бульона и выдерживают еще сутки. Затем содержимое чашки фильтруют через марлю, потом свечи Шамберлана или фильтр Зейтца.

б). Определяют летальность токсина, вводя его лабораторным животным (кролики и пр.) внутривенно по 0,1-0,5 мл фильтрата в разных разведениях стерильной дистиллированной водой. Определяют DLV50 (дозу летальности 50 %), когда от определенной дозы токсина гибнет 50 % опытных животных.

2. Определение токсигенных свойств C.diphtheriae.

Расплавляют агар Мартена при 90о С в водной бане.

Охлаждают до 500 С и добавляют 20 % сыворотки крови КРС. Смесь перемешивают и выливают в чашку Петри, давая ей равномерно растекаться по дну чашки. В центр чашки на застывающий агар обожженным пинцетом накладывают бумагу фильтровальную, заранее пропитанную сывороткой антитоксической противодифтерийной.

Подсушивают чашку в термостате 15-20 мин, затем переворачивают вверх дном

Затем на чашку засевают культуру в виде бляшек, диаметром 0,6-0,7 см, на расстоянии 0,7-0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку наносят не более 10 бляшек разных культур, из них 4- контрольные, три - tox+ и одна - tox- культуры.

После экспозиции 2-4 суток, наблюдают следующие виды результатов:

1. Испытуемые культуры являются токсигенными, если их линии преципитации могут сливаться с другими культурами положительными и контролем (+).

2. Используемые культуры нетоксигенные, если линии их преципитации не сливаются с линиями, образованными положительными культурами и (+) контролями, они могут даже перекрещиваться с линиями специфическими.

3. Некротические свойства токсина. Делают разведения фильтрата от 1:20 до 1:10240 на дистиллированной воде.

Вводят кролику по 0,2 мл фильтрата. Токсин средней силы при этой пробе вызывает образование некроза в разведении 1:1200 через 24-48 ч.

Мышам вводят по 0,1 мл столбнячного токсина. Через 24-48 ч появляются признаки поражения центральной нервной системы, выражающиеся в спастических сокращениях отдельных мышечных групп, а затем гибели мышей от паралича дыхательных мышц.

4. Определение гемолитической активности токсина. Готовят ряд последовательных разведений токсина на 0,85 % растворе хлорида натрия, начиная с 1:10 и далее до 1: 10000. К 1 мл каждого разведения токсина добавляют по 1 мл 20 % взвеси нативных эритроцитов кролика, отмытых трижды изотоническим раствором хлорида натрия. В отдельную пробирку вместо токсина вводят растворитель. Пробирки ставят на 2 ч в термостат, затем на 2 ч при комнатной температуре, после чего учитывают результат. Полный лизис ++++, лизис почти полный +++, не полный лизис и значительный осадок на дне ++, лизис отсутствует (-).

Ферменты

1. Определение каталазы. На предметное стекло наносят 2 капли 3 % раствора перекиси водорода. В первую каплю платиновой петлей вносят культуру S.aureus и равномерно ее растирают круговыми движениями петли. После этого петлю прожигают и во вторую каплю вносят таким же образом культуру S.pyogenes. При наличие фермента каталазы - происходит расщепление перекиси водорода, что сопровождается выделением пузырьков газа (культура стафилококка). При отрицательной реакции расщепления перекиси водорода не последует - будут отсутствовать пузырьки газа (стрептококк - каталаза отрицательный).

2. Определение гиалуронидазы. В пробирку с культурой испытуемых бактерий вносят по 0,5 мл гиалуроновой кислоты и после экспозиции при 370 С в течение 30 мин добавляют 2 капли 2 n раствора уксусной кислоты. Параллельно делают контроль без микробной взвеси. В контроле выпадает слизистый комочек. В опыте этого не происходит

3. Определение коагулазы. Свежую плазму крови разводят в 5 раз стерильным 0,85 % раствором хлорида натрия и разливают по 0,5 мл по стерильным пробиркам. В пробирку вносят 1 петлю агаровой суточной культуры исследуемого штамма и суспендируют в плазме. Во вторую пробирку вносят заведомо коагулазо (+) штамм и в третью пробирку - коагулазо (-) штамм и еще оставляют пробирку с незасеянной плазмой. Штатив помещают в термостат при 370 С и регистрируют результат через 1, 2, 4, 18 ч инкубации.

Появление на дне 1-ой и 2-ой пробирок студнеобразного сгустка любого размера – есть положительный результат. Отсутствие свертывания плазмы через 18 ч можно расценивать как отрицательный результат.

4. Определение ДНКазы. К 100 мл расплавленного 1,8 % мясо-пептонного агара рН 8,6 добавляют раствор ДНК (50 мг, 100 мг или 200 мг высокополимерной ДНК растворяют в 3-5 мл дистиллированной воды, подщелоченной 4-5 каплями 2 М раствора NaOH) и прогревают среду 20 мин в кипящей водяной бане. Затем в слегка охлажденный агар вносят раствор 10 % стерильного CaCO2 (0,5 мл) , перемешивают и разливают тонким слоем в чашки Петри.

Суточную агаровую культуру исследуемого штамма засевают короткими штрихами на поверхность подсушенного агара. На одну чашку можно засеять до 16 штаммов. После 18-24 ч инкубации при 370 С поверхность агара заливают 5-8 мл 3 М раствора HCl. Через 2 мин кислоту сливают и регистрируют результат.

Появление вокруг культуры непрозрачной зоны (деполимеризация ДНК), которая в 4 раза превосходит по ширине зону микробного роста (2-3 мл зона роста) свидетельствует о положительной реакции на ДНКазу. Меньшая доза деполимеризации должна расцениваться как сомнительный результат.

5. Определение фосфатазы. Фенолфталеинфосфат натрия добавляют в концентрации 0,01 % к 100 мл расплавленного и охлажденного 1,8 % питательного агара, перемешивают и разливают в чашки Петри. Суточные агаровые культуры исследуемых штаммов засевают на чашку с помощью петли. Инкубируют в течение 18-24 ч при 370 С. После инкубации на крышку чашки Петри наливают 5-6 капель 25 % раствора аммиака, выдерживают чашку в перевернутом виде на крышке 5-10 мин, подвергая культуру действию паров аммиака и регистрируют результат. О положительной реакции свидетельствует розовое окрашивание микроколоний.

6. Определение гемолизина. В чашки с кровяным агаром засевают методом бляшек исследуемую культуру бактерий. В эту же чашку засевают культуры заведомо tox+ и tox- контроли.Чашку инкубируют в термостате при 370 С в течение 18-24 ч. Затем проводят учет реакции, начиная с контролей. Наличие гемолизина у исследуемой культуры регистрируют по появлению вокруг бляшек зоны гемолиза - просветление кровяной среды.

Факторы адгезии Наличие у бактерий пилей - факторов адгезии выявляется в маннозочувствительных и маннозорезистентных реакциях гемагглютинации. В планшеты для микротитрования вносят 4 % взвесь отмытых эритроцитов человека, 1 % раствор D-маннозы и суспензию испытуемых бактерий в концентрации 109 клеток в 1 мл. Каждый компонент добавляют в дозе 0,05 мл

Реакцию гемагглютинации учитывают как положительную, если в течение 30-60 мин происходит склеивание эритроцитов человека. Они оседают на дно лунок в виде широкого осадка, условно обозначаемого как «зонтик». Отрицательная реакция проявляется оседанием эритроцитов в виде маленькой «точки» или «колечка».







Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 646. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!


Рекомендуемые страницы:


Studopedia.info - Студопедия - 2014-2022 год . (0.003 сек.) русская версия | украинская версия