Приемы микроскопирования живых микроорганизмов

Нативные (прижизненные) препараты готовят для исследования живых неокрашенных бактерий. Наиболее распространенными являются методы «висячей капли», «раздавленной капли», «отпечаток», «агаровая пленка», микрокамеры с плотными средами. Препараты живых клеток обычно рассматривают с «сухими» системами микроскопа. Для прижизненного изучения бактерий часто используют фазово-контрастную и темнопольную микроскопию.

Морфологическое разнообразие бактерий можно изучить при приготовлении негативного тушевого препарата, когда окрашивают суспензию тушью. В поле зрения микроскопа на общем темном фоне туши отчетливо видны неокрашенные клетки микроорганизмов различной формы, разных размеров, расположенные в разнообразных сочетаниях.

Препараты, работа с которыми закончена, прежде чем вымыть, выдерживают в дезинфицирующем растворе.

Препарат «раздавленная капля». На предметное стекло наносят каплю стерильной водопроводной воды, помещают в нее небольшое количество клеток изучаемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом. Для этого покровное стекло ставят на ребро у края капли и постепенно опускают на нее. Микроорганизмы, выращенные на плотной или в жидкой питательной среде, переносят в каплю воды бактериологической петлей; выращенные в жидкой среде – переносят стерильной пипеткой. В последнем случае каплю воды на предметное стекло можно не наносить. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы из-под покровного стекла не выступал избыток жидкости. Если он образовался, его необходимо удалить фильтровальной бумагой. Препарат можно микроскопировать с использованием иммерсионной системы.

Препарат «висячая капля». Каплю суспензии микроорганизмов петлей или обычным пером наносят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что делает возможным многодневное наблюдение за объектом. При работе с бактериями этот метод используется редко.

Препарат «отпечаток». Из агаризованой среды, на которой растут микроорганизмы, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят на предметное стекло так, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или к колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего (1: 40) на предметное стекло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии или газона предметным стеклом. Препарат «отпечаток» используют в основном при исследовании спороношения стрептомицетов.

Препарат «микрокультура» ( или «агаровая пленка»). На тонкое, простерилизованное и нагретое предметное стекло наносят стерильной нагретой пипеткой 0, 2–0, 3 мл горячей агаризованной питательной среды и распределяют ее по всей поверхности стекла. После застывания среды удаляют петлей лишний агар, оставляя два тонких участка пленки величиной с покровное стекло каждый. В центр квадратов бактериальной петлей или пипеткой наносят каплю жидкой культуры или суспензии клеток микроорганизма. Стекло помещают во влажную камеру (чашка Петри со слоем мокрой фильтровальной бумаги), которую ставят в термостат. Перед микроскопированием на пленку с выросшей микрокультурой наносят каплю красителя или каплю воды в случае подсыхания пленки, и затем осторожно накрывают покровным стеклом.

Выращивание микроорганизмов непосредственно на предметном стекле позволяет вести микроскопическое наблюдение за процессами их роста и развития, изучать цикл развития, способ размножения (деление-почкование), влияние на эти процессы каких-либо агентов. На препаратах не нарушается естественное расположение клеток в растущей микроколонии. Выращивание микроколонии можно проводить в аэробных или анаэробных (под покровным стеклом, загерметизированном лаком) условиях.

Агаровую пленку можно нанести на покровное стекло и приготовить препарат «висячая капля». На таком препарате можно наблюдать движение бактерий по типу скольжения. Движение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя в большинстве случаев светлопольный микроскоп. Наиболее эффективно наблюдение за подвижностью в темнопольном микроскопе.

 

Вопросы для самоконтроля

 

1 Перечислите основные задачи микроскопии.

2 Охарактеризуйте следующие виды микроскопии: светлопольная, фазово-контрастная, темнопольная, люминесцентная, электронная, сканирующая, компъютерная интерференционная.

3 Каково устройство светлопольного микроскопа?

4 В чем сущность иммерсионного метода микроскопирования?

5 Охарактеризуйте способы приготовления препаратов живых клеток микроорганизмов.