Опыт № 1. Биуретовая реакция на пептидную группу

Метод основан на способности пептидной группы белков и полипептидов белковых биополимеров образовывать в щелочной среде с ионами Сu²⁺ комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком в зависимости от числа пептидных связей в белке.

Биуретовая реакция положительна с белками и полипептидами, имеющими не менее двух пептидных связей (− С − NН −). С ди- и

О

трипептидами она неустойчива.

Енольная форма полипептида, образованная в сильнощелочной среде, дает отрицательный заряд, и кислород, взаимодействуя с медью, образует ковалентную связь, а взаимодействуя с атомами азота, медь образует координационные связи.

В сильнощелочной среде пептидные группы полипептидов переходят в енольную форму, в которой и взаимодействуют с ионами Сu²⁺, образуя окрашенный биуретовый комплекс. Биуретовая реакция схематично протекает так:

Н R₂ О Н R₄ О + 2Nа(ОН)

+ Сu(ОН)

Н₂N - СН - С - N - СН - С - N - СН - С - N - СН - С - N - СН -…

 

R₁ О Н R₃ О Н R₅

R₂ ОН R₄ ОН

Н₂N - CН - С = N - CН - С = N - CН - С = N - CН - С = N – CН …

 

R₁ ОН R₃ ОН R₃

 

 

Образование ковалентной связи меди с атомами азота возможно при наличии NH – и NН₂ − групп, например, в случае биуретовой реакции с гистидином при больших его концентрациях при наличии кетоенольных группировок.

Степень окраски биуретового комплекса зависит от концентрации белка и количества медной соли в растворе.

Выполнение работы

а) белок одного крупного яйца встряхивают в колбе со 120 мл дистиллированной воды, смесь фильтруют через кусочек полотна. Получают слегка опалесцирующий раствор альбумина;

или к 50 мл молока добавляют 50 мл воды и по каплям 0, 3 мл концентрированной уксусной кислоты до образования хлопьев. Затем смесь фильтруют. Получают раствор альбумина.

К 1 мл раствора белка добавить равные объемы растворов щелочи и сульфата меди (II). Наблюдается окрашивание жидкости в ярко фиолетовый цвет.

б) небольшой кусочек шкурки (не более 0, 3–0, 5 см) опускают в раствор: 10 капель 10 %-го раствора NаОН, 4 капли 1 %-го раствора CuSО₄ и все перемешивают, содержимое пробирки приобретает фиолетовый цвет с синим или красным оттенком. Нельзя добавлять избыток сульфата меди, т. к. синий осадок гидрата окиси меди маскирует фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка.

Задания: 1. Указать, каковы внешние признаки положительной биуретовой реакции.

2. Указать, все ли белки дают биуретовую реакцию.