Рост бактерий в периодической культуре

 

При внесении бактерий в питательную среду они обычно растут до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов обмена, то получим так называемую периодическую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном про-странстве). Рост в такой «закрытой системе» подчиняется закономерностям, действительным не только для одноклеточных, но и для

многоклеточных организмов. Периодическая культура ведет себя как многоклеточный организм с генетически ограниченным ростом.

Кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени, называется кривойроста. Типичная кривая роста(рис. 6.6)имеетS-образную форму и позволяет различить несколько фаз роста,сменяющих друг друга в определенной последовательности и в большей или меньшей степенивыраженных: начальную (или лаг-) фазу, экспоненциальную (или логарифмическую) фазу, стационарную фазу и фазу отмирания.

Рост микроорганизмов на твердых питательных средах протекает в основном так же, хотя при этом достигаются значительно более высокие плотности клеток.

 

Начальная фаза. Эта фаза охватывает промежуток времени между инокуляцией и достижениеммаксимальной скорости деления. Продолжительность этой фазы зависит главным образом от предшествовавших условий культивирования и возраста инокулята, а также от того, насколько пригодна для роста данная среда. Если инокулят взят из старой культуры (в стационарной фазе роста), то клеткам приходится сначала адаптироваться к новым условиям путем синтеза РНК,образования рибосом и синтеза ферментов. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от тех, какие были в предшествующей культуре, то приспособление (адаптация) к новым условиям может быть связано с синтезом новых ферментов, которые ранее не были нужны и поэтому не синтезировались. Образование новыхферментов индуцируется новым субстратом.

Хорошим примером влияния субстрата на синтез ферментов служит так называемая диауксия (рис. 6.7). Это явление двухфазного роста или двойного цикла роста наблюдается на средах, содержащих смесь пита-тельных веществ. Из смеси глюкозы и сорбитола Escherichia coli, например, поглощает в первую очередь глюкозу. Глюкоза индуцирует сначала в клетках синтез ферментов, которые нужны для ее использования.и одновременно подавляет (репрессирует) синтез ферментов, необходимых для использования сорбитола. Эти последние ферменты образуются лишь после того, как вся глюкоза будет израсходована. Такие регуляторные процессы достаточно хорошо объясняют наличие двух начальных фаз.

Количественное изменение состава бактериальной клетки во время начальной фазы роста сильнее всего затрагивает рибонуклеиновую кислоту: содержание РНК повышается в 8-12 раз. Это указывает на участие РНК и рибосом в синтезе ферментных белков.

Экспоненциальная фаза. Экспоненциальная(логарифмическая)фаза роста характеризуетсяпостоянной максимальной скоростью деления клеток. Эта скорость во время экспоненциальной фазы зависит от вида бактерий, а также от среды. Энтеробактерии делятся через каждые 15-30 мин, Escherichia coli при 37°С-примерно каждые 20 мин. У других бактерий время генерации значительно больше: у многих почвенных видов оно достигает 60-150 мин, а у Nitrosomonas и Nitrobacter -даже 5-10 ч.

Величина клеток и содержание в них белка у многих бактерий тоже остаются в экспоненциальной фазе постоянными. В известном смысле можно сказать, что бактериальная культура в этом случае состоит из «стандартных клеток». Если точно установлено, что число клеток, содержание в них белка и их сухая биомасса увеличиваются с одинаковой скоростью, то за ростом культуры можно следить, пользуясь каким-ни-будь одним из этих показателей.

Нередко, однако, и в экспоненциальной фазе роста клетки периодической культуры претерпевают изменения, так как постепенно изменяется среда: уменьшается концентрация субстрата, увеличивается плот-ность клеточной суспензии и накапливаются продукты обмена. В связи с тем что в экспоненциальной фазе скорость деления клеток относительно постоянна, эта фаза наиболее удобна для определения скорости деления (и скорости роста). Изучая влияние факторов среды (рН, окислительно-восстановительного потенциала, температуры, аэрации и т. д.), а также пригодность различных субстратов, следят за увеличением числа клеток или за мутностью (экстинкцией) клеточной суспензии во время экспоненциального роста.

Стационарная фаза. Стационарная фаза наступает тогда,когда число клеток перестает увеличиваться.Скорость роста зависит от концентрации субстрата-при уменьшении этой концентрации, еще до полного ис-пользования субстрата, она начинает снижаться. Поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Скорость роста может снижаться не только из-за нехватки субстрата, но также из-за большой плотности бактериальной популяции, из-за низкого парциального давления 0₂ или

накопления токсичных продуктов обмена; все эти факторы вызывают переход к стационарной фазе. И в ста-ционарной фазе могут еще происходить такие процессы, как использование запасных веществ, распад части рибосом и синтез ферментов. Наблюдаемая картина зависит от того, какой именно фактор лимитирует рост. Быстро гибнут лишь очень чувствительные клетки; другие еще долго сохраняют жизнеспособность-до тех пор, пока есть возможность получать необходимую для этого энергию в процессе окисления каких-либо запасных веществ или клеточных белков.

Количество биомассы, достигнутое в стационарной фазе, называют выходом или урожаем. Урожай зависит от природы и количества используемых питательных веществ, а также от условий культивирования.

Фаза отмирания. Фаза отмирания и причины гибели бактериальных клеток в нормальных питательныхсредах изучены недостаточно. Сравнительно легко понять случаи, когда в среде накапливаются кислоты (при росте Escherichia, Lactobacillus). Число живых клеток может снижаться экспоненциально. Иногда клетки лизируются под действием собственных ферментов (автолиз).

 

В 50-е годы 20 века был разработан метод непрерывного культивирования микроорганизмов (метод проточных культур). Сущность метода состоит в том, что в культиватор, где производится выращивание бактерий, все время поступает свежая питательная среда и одновременно с такой же скоростью выводится культуральная жидкость. В результате для микроорганизмов создаются неизменные условия в отношении наличия питательных веществ и фактически отсутствия продуктов обмена. Регулируя скорость проточной среды, можно управлять развитием бактериальной популяции, например, задержать культуру в логарифмической фазе роста на любое длительное время.

 

Синхронные культуры Синхронные культуры – это бактериальные культуры или популяции, в которой все клетки находятся на одинаковой стадии клеточного цикла. В естественных культурах – периодических и проточных – такого явления не наблюдается. Даже в экспоненциальной фазе роста в культуре содержатся неделящиеся и находящиеся на разных стадиях деления клетки. Синхронное деление клеток вызывают искусственно, воздействуя на культуру различными факторами, например, пониженной или повышенной температурой. Считается, что неблагоприятные температуры больше сказываются на развитии делящихся клеток, более чувствительных к действию различных факторов. В результате происходит торможение развития. За это время к делению подготовятся другие клетки культуры. Следующее за ним воздействие оптимальной температуры постепенно вызывает синхронное деление клеток. Для получения синхронных культур используют метод вынужденного голодания. Клетки помещают на неполноценную среду, культивируют, затем переносят на полноценную. У фотосинтезирующих бактерий синхронные культуры получают чередованием световых и темновых режимов культивирования. Также используют механические методы: пропускание культуры через специальные фильтры (отбор клеток одинакового размера) и центрифугирование (клетки, находящиеся в начале цикла деления, более мелкие и оседают медленнее).

 

Синхронные культуры используют для изучения синтеза отдельных клеточных компонентов в процессе деления клетки

46. Систематика и номенклатура прокариот.Современные направления в систематикепрокариот: фенотипический подход, геносистематика, филогенетическая систематика. Искусственные системы классификации. Правила и термины номенклатуры и диагностики. Клон, культура, популяция бактерий. Понятие «вид» у прокариот.

Систематика (таксономия) —наука,занимающаяся вопросами классификации,номенклатуры иидентификации микроорганизмов. Задачей классификации является объединение микроорганизмов с общими свойствами в определенные группы (таксоны). Номенклатура — система наименований, применяемых в определенной области знаний. Идентификация — отнесение микроорганизмов к определенному таксону (виду) на основании конкретных признаков.

Для того чтобы отнести микроорганизм к той или иной таксономической группе, необходимо определить основные его признаки: морфологию, подвижность, окраску по Граму, наличие капсулы и способность к образованию эндоспор, культурально-биохимические свойства и некоторые другие признаки. В классификации для группирования родственных организмов используют следующие таксономические категории: царство

 

(regnum), отдел (divisio), секцию (section), класс (classis), порядок (ordo), семейство (familia), род (genus), вид

(species).

Основной номенклатурной единицей является вид. В. Д. Тимаков (1973) даст следующее определение ему: «Вид — это совокупность микроорганизмов, имеющих единое происхождение и генотип, сходных по морфологическим и биологическим свойствам, обладающих наследственно закрепленной способностью вызывать в среде естественного обитания качественно определенные специфические процессы». Вид подразделяют на подвиды или варианты. Имеются также и инфраподвидовые подразделения, которые

основаны на отличии особей каким-либо небольшим наследственным признаком: антигенным — серовар, биохимическим — биовар, отношением к фагам — фаговар, патогенностью — патовар и др.

В микробиологии пользуются терминами «штамм» и «клон». Штамм — культура одного и того же вида, выделенная из разных объектов и отличающаяся незначительными изменениями свойств (например, чувствительностью к антибиотикам, ферментацией углеводов и др.). Под термином «культура» понимают микроорганизмы, выращенные на плотной или жидкой питательной среде в условиях лаборатории. Клон — это культура, полученная из одной клетки. Культуру микроорганизмов, полученную из особей одного вида, называют чистой культурой. Смешанной культурой называют смесь неоднородных микроорганизмов, выделенных из исследуемого материала (молока, почвы, воды, патматериала).

В микробиологии существует два различных подхода к систематике, обусловливающие два вида классификации. В основе первого лежит идея создания естественной (филогенетической) классификации прокариот, т. е. построения единой системы, объективно отражающей родственные отношения между разными группами и историю их эволюционного развития. Второй подход к систематике преследует практические цели и служит для идентификации, т. е. установления принадлежности микроорганизма к определенному виду. Это искусственная классификация (традиционная). Современные системы классификации микроорганизмов, по существу, являются искусственными. Этому служат определители, которыми пользуются главным образом при идентификации того или иного микроорганизма. К таким определителям относятся: «Определитель бактерий и актиномицетов» Н. А. Красильникова (1949), «Определитель микробов» Р. А. Циона (1948) и др. К международным определителям бактерий относится «Руководство по систематике бактерий» Д. X. Берги, девятое издание которого вышло в 1984 г. В этом определителе все прокариотические микроорганизмы объединены в царство Procaryotae, которое подразделяется на четыре отдела. Они, в свою очередь, делятся на секции, классы, порядки, семейства, роды, виды.

Существует также фенотипическая классификация. Слово «фенотипический» происходит от греч. phainomenon, т. е. «то, что мы видим». Эта классификация основана исключительно на внешних, т. е. видимых, признаках (фенотипическое сходство), причем все учитываемые признаки считаются одинаково важными. Учитываться могут самые разнообразные признаки организма по принципу чем больше, тем лучше. И совсем необязательно, чтобы они отражали эволюционные связи. Когда накапливается определенное число данных, на их основе рассчитывается степень сходства между различными организмами; обычно это делается с помощью компьютера, поскольку расчеты крайне сложны.

Генная систематика основана на способности бактерий с гомологичными ДНК к трансформации, трансдукции и конъюгации, на анализе внехромосомных факторов наследственности – плазмид, транспозонов, фагов.