Метод биолюминесценции

Биолюминесценция (БЛ) - это свечение живых организмов, видимое простым глазом. Способностью к БЛ обладают организмы, принадлежащие к самым разным систематическим группам: бактериям, грибам, моллюскам, насекомым. Механизм реакций, сопровождающихся свечением, различен у разных видов, однако обычно включает в себя химическое превращение определенного низкомолекулярного субстрата, называемого люциферином, катализируемое ферментом люциферазой.

Биолюминесценция светящихся бактерий. К числу светящихся относится немного видов бактерий. Хемилюминесцентная реакция, непосредственно сопровождаемая свечением, катализируется ферментом - бактериальной люциферазой и включает в себя процессы окисления восстановленного флавинмононуклеотида ФМН-Н2 до ФМН и одновременно алифатического (С14) альдегида до миристиновой (С14) кислоты. Эта реакция протекает, по-видимому, через стадию образования пероксида флавинмононуклеотида:

ФМН-H2 + E + O2 E-ФМН-H2-OOH

RCOH-E-ФМН-H2-OOH

RCOOH + E-ФМН-HOH*

RCOOH + E + ФМН + H2O + фотон (490 нм).

Здесь E - люцифераза, OOH - гидроперекисная группа, RCOH - алифатический альдегид, RCOOH - жирная кислота, образующаяся при окислении альдегида.

В последние годы получают все большее распространение биохимические анализы, в которых в качестве тест-объекта используют целые бактериальные клетки (в суспензии), экстракты светящихся бактерий, изолированный фермент - люциферазу. В таблице приведены некоторые примеры использования бактериальной биолюминесценции в биохимических анализах.

Прежде всего измерение биолюминесценции бактерий можно использовать для определения низких концентраций кислорода. Дело в том, что при отсутствии кислорода фотобактерии не обладают свечением, свечение усиливается пропорционально концентрации кислорода в среде в интервале концентраций О2 от 2 i i 10- 8 до 5 " 10- 6 моль/л.

Можно использовать светящиеся бактерии и в качестве лабораторного животного, то есть живых организмов, на которых изучают действие различных токсических веществ. Светящиеся бактерии чувствительны к примесям токсических веществ в воде, и измерение биолюминесценции можно использовать для оценки загрязнения воды токсическими соединениями, например ионами тяжелых металлов. Кроме того, свечение бактерий можно использовать для предварительной оценки эффективности новых антибиотиков [21].

Результаты и их обсуждение

Оценка содержания санитарно-показательных микроорганизмов

Оценка санитарно-показательных микроорганизмов проводилась на примере молока пастеризованного. Определение БГКП основано на способности сбраживать в среде Кеслера лактозу, после чего образуется кислота и газ.

Рассчитаем общее число микроорганизмов в молоке, полученных методом посева, по формуле:

N = A·10^f /V₂,

где А – число колоний, f – степень разведения, V₂ – объем пробы, наносимый на поверхность питательной среды.

Результаты представим в виде таблицы:

 

 

Таблица 3 – Содержание микроорганизмов в молоке

Показатель	КМАФАнМ	БГКП	Среда Козера	E.coli
a		+	-	>0,3 см3
	+	-
f		+	-
V
Ni, кл/мл	2,5×103
1,6×103
Ncp, кл/мл	2,05×103
CKO, кл/мл	0,45×103
e, %	21,9

N=(2,05±0,45)×10³ кл/мл

 

Сравним полученные результаты с допустимым содержанием микроорганизмов, установленным СанПиН.

 

 

Таблица 4 –Нормирование содержания микроорганизмов в молоке

Продукт	КМАФАнМ, КОЕ/г,не более	Масса продукта (г), в которой не допускается наличие
БГКП(коли формы)	Патогенных микроорганизмов, в том числе сальмонелл и листерий
Молоко сырое: высший сорт; первый сорт; второй сорт	3х105 5х105 4х106	- - -
Молоко пастеризованное: в потребительской таре; во флягах	1х105 2х105	0,01 0,01

 

В результате работы установлено, что в молоке общее количество бактерий составляет N=(2,05±0,45)×10³ кл/мл, что соответствует требованиям СанПиН от 09.06.2009 №63, по которому значение данного показателя не должно превышать 1×10⁵ кл/мл. Коли‑титр в молоке составляет >0,3 см³, следовательно, коли‑индекс равен 3,3×10³ кл/ см³.

Качество проведенных опытов незначительно превышает требования, установленные в НД (20%).