Лабораторная работа. 1. Обнаружения альдегидоксидазы в молоке

1. Обнаружения альдегидоксидазы в молоке.

 

Оборудование:1. Глазные пипетки.

2. Штатив с пробирками.

3. Термостат.

 

Реактивы: 1. 0,4% раствор формальдегида.

2. Метиленовая синь.

3. Растительное масло.

4. Молоко.

Принцип метода. Альдегидоксидаза молока является флавопротеидом, способным окислять альдегиды. При добавлении к некипяченому молоку формальдегида и метиленовой сини фермент окисляет альдегид в муравьиную кислоту, а освободившийся при этом водород передается на метиленовую синь, восстанавливая ее в бесцветное состояние. Реакцию используют, чтобы отличить кипяченое молоко от некипяченого.

 

Ход работы. В 2 пробирки наливают по 15 капель молока. Молоко в одной из них кипятят на спиртовке, затем охлаждают. В обе пробирки вносят по 1-2 капли 0,4% раствора формальдегида и по 1 капле раствора метиленовой сини. Содержимое пробирок перемешивают и добавляют несколько капель масла для создания анаэробных условий. Пробирки помещают в термостат при 37^ОС и отмечают постепенное обесцвечивание.

 

2. Дегидрогеназы цикла Кребса

Принцип метода. При окислении субстратов цикла Кребса ферментами скелетных мышц выделяется водород, который в тканях акцептируется коферментами, а в пробирке переходит на искусственный акцептор – метиленовую синь. При этом она обесцвечивается. Опыт проводят в анаэробных условиях (под слоем масла) для предотвращения восстановления окраски сини.

 

Оборудование:1. Глазные пипетки, пипетки на 1 мл.

2. Штатив с пробирками.

3. Термостат.

 

Реактивы: 1. 3% раствор цитрата натрия.

2. 3% раствор сукцината натрия.

3. 20% раствор сульфосалициловой кислоты.

4. Метиленовая синь.

5. Растительное масло.

6. Мышечная кашица.

 

Ход работы. В 3 пробирки вносят равные количества мышечной кашицы. В первую пробирку добавляют 1 мл 3% раствора цитрата натрия, во вторую – 1 мл 3% раствора сукцината натрия, в третью – 1 мл 20% раствора сульфосалициловой кислоты. Если между кусочками мышц остались пузырьки воздуха, их удаляют стеклянной палочкой. Затем в каждую пробирку добавляют по 2 капли метиленовой сини и несколько капель масла. Помещают пробирки в термостат при 37^ОС и наблюдают за обесцвечиванием сини. Объяснить, почему в пробирке с сукцинатом обесцвечивание идет быстрее, чем в пробирке с цитратом. Почему нет обесцвечивания в пробирке с сульфосалициловой кислотой?

 

3. Влияние малоната на активность сукцинатдегирогиназы (СДГ)

Оборудование:1. Глазные пипетки, пипетки на 1 мл.

2. Штатив с пробирками.

3. Термостат.

 

Реактивы: 1. 3% раствор сукцината натрия.

2. 1% раствор малоната.

4. Метиленовая синь.

5. Растительное масло.

6. Мышечная кашица.

 

Малоновая кислота является конкурентным ингибитором СДГ.

Ход работы. В 3 пробирки вносят равные количества мышечной кашицы. В первую добавляют 0,4 мл воды, во вторую – 0,2 мл 1% раствора малоната, в третью – 0,4 мл 1% раствора малоната. Во все пробирки добавляют по 1 мл 3% раствора сукцината натрия и по 2 капли метиленовой сини, перемешивают и добавляют несколько капель масла. Пробирки помещают в термостат при 37^ОС, через 10 мин вынимают, сравнивают окраску и делаю выводы.

 

 

4. Определение активности каталазы в слюне

 

Каталаза содержится во всех тканях и жидкостях организма, но особенно много ее в строме эритроцитов и печени. В процессе окисления некоторых веществ образуется пероксид водорода, ядовитый для организма. Каталаза расщепляет пероксид водорода на молекулярный кислород и воду.

 

Оборудование: 1. Пипетки на 1мл.

2. Коническая мерная пробирка.

3. Химический стакан объемом 100 мл.

4. Штатив с пробирками.

 

Реактивы: 1. 0,9% раствор NaCl.

2. 10% pаствоp Н₂SO_4.

3. 1,5% pаствоp Н₂О_2.

4. 0,1н pаствоp KMnO₄.

 

Принцип метода. Метод основан на титрометрическом определении количества пероксида водорода, оставшегося в пробе после действия фермента. Пероксид водорода оттитровывают 0,1н раствором KMnO₄.

 

Ход работы. В две пробирки (контрольная и опытная) вносят по 1 мл 0,9% раствора NaCl, 0,3мл 1,5% раствора Н₂О₂ и 0,5 мл неразведенной слюны. Опытную пробу оставляют на 15 мин при комнатной температуре, а в контрольную пробу сразу же после добавления слюны приливают 3 мл 10% Н₂SO₄ и титруют 0,1 н раствором KMnO₄ до появления слабо-розовой окраски, не исчезающей 30 сек. В опытную пробу через 15 мин инкубации тоже добавляют 3 мл 10% pаствоpа Н₂SO₄ и титруют так же, как контрольную.

Расчет активности каталазы проводят по формуле:

 

Х = (К – О) х 0,3 мг Н₂О₂/мл в минуту, где

К – количество KMnO₄, пошедшее на титрование контроля,

О - количество KMnO₄, пошедшее на титрование опыта,

0,3 – коэффициент, учитывающий титр Н₂О₂, количество слюны в пробе и время инкубации.

 

Проверка качества усвоения знаний (конечный уровень)

А) Вопросы для защиты лабораторной работы

 

1. Что такое дегидрогеназа?

2. Чем дегидрогеназы отличаются от оксидаз?

3. Приведите примеры известных вам дегидрогеназ и оксидаз.

4. Зачем в первом опыте использовали метиленовую синь и растительное масло?

5. С помощью какой биохимической реакции можно доказать, что молоко не кипяченое?

6. К какому классу ферментов относится альдегидоксидаза? Какие реакции она катализирует?

7. Почему происходит обесцвечивание метиленовой сини?

8. Зачем пробирки с реакционной смесью помещают в термостат?

9. Напишите уравнение каталазной реакции. Какое значение в организме она имеет?

10. К какому классу ферментов относится каталаза?

11. Что является субстратом каталазы?

12. На чем основан принцип метода определения каталазы?

13. Где в организме встречается каталаза?

14. Как определить окончание титрования?

15. Как рассчитать активность каталазы? Приведите формулу.

16. В каких единицах выражается активность каталазы?