ЭлектрофорезМетод анализа, основанный на способности заряженных частиц к пере-движению во внешнем электрическом поле называют электрофорезом (от “электро” и греческого phoresis -- перенесение). Электролиз относится к методам разделения без превращения веществ, на основе заряда частиц. По технике выполнения метод аналогичен хроматографии, поэтому и рассматривается в этой главе. Рис 3.5.1. Схема прибора для электрофореза. Нередко под электрофорезом понимают перемещение коллоидных час-тиц или макромолекул, в отличие от иовофореза - перемещения неоргани-ческих ионов малого размера. Передвижение частиц при электрофорезе зависит от ряда факторов, ос-новными из которых являются: напряженность электрического поля; вели-чина электрического заряда; скорость и размер частицы; вязкость, рН и температура среды, а также продолжительность электрофореза. Электрофорез можно проводить как в свободном растворе (фронталь-ный электрофорез), так и на носителях (зональный электрофорез). Послед-ний вариант предпочтительнее, т.к. носители способствуют стабилизации электрофоретических зон. В качестве носителей используют: фильтро-вальную бумагу, силикагель, крахмал, оксид алюминия, поливинилхлорид, агаровый и полиакриламидный гели и др. Электрофоретическое разделение осуществляют на бумаге, в тонком слое сорбента, колонке или в блоке (который часто формируют из суспен-зии крахмала в подходящем электролите). Аппаратура для электрофо-реза выполняется по единой схеме: источник тока, камера для электрофореза, два элек-трода, соединяющих камеру с источником тока и приспособ-ление для сбора и идентифика-ции разделенных веществ (по-следний блок в некоторых слу-чаях отсутствует). Для элек-трофореза используют как готовые наборы аппаратуры (универсальный прибор для иммуноэлектрофореза и электрофореза белков на бумаге и крахмале, набор для электрофоре- за в полиакриламидном геле венгерской фирмы Реанал), так и наборы, со-ставляемые экспериментатором из отдельных приборов. На рис. 3.5.1 представлена схема прибора для электрофореза на бумаге. Электрофоретическая камера состоит из двух кювет, в которые помещают графитовые электроды и раствор проводящей жидкости (буферный рас-твор). Выше кювет находится подставка для носителя бумаги. Смесь ве-ществ, подлежащих разделению, наносят на пропитанную проводящей жидкостью бумагу. Бумагу подсушивают, помещают на подставку, концы погружают в кюветы, затем камеру плотно закрывают крышкой. После пропитывания бумаги проводящей жидкостью подключают электрический ток. По окончании электрофореза бумагу подсушивают. Качественную и количественную оценку осуществляют, применяя методы, используемые в бумажной хроматографии, например, проявление белков с помощью кра-сителей, количественную оценку - методом денситометрии. Важной областью применения электрофореза является анализ белков сыворотки крови, аминокислот гидролизатов белков, нуклеиновых кислот и т.п. В кислотном буферном растворе аминокислота находится в виде катиона NHз+......COOH, который будет перемещаться к катоду, в то время как в щелочном буфере аминокислота превращается в анион NH2....COO-, и будет дви-гаться к аноду. В изоэлектрической точке аминокислота находится в растворе в виде биполяр-ного иона NH3+......COO- и не будет передвигаться в электрическом поле. Рис. 3.5.2. Электрофореграмма (а) и схемы (б) белковых фракций. A - белковые фракции сыров: 1, 17 - российского, 2, 16 - волжского, 3, 15 - “Орбита”, 4, 14 - колбасного, 5, 13 - голландского, 6, 12 - пошехонского, 7, 11 - “сырного” казеина после осаждения при pH 4,6, 8, 10 - молочной сыворотки, 9 - казеина по Гаммерстену, 18 - “городского”. Б - белковые фракции сыра (I), сырного казеина (II) Ввиду того, что отдельные белки и аминокислоты имеют различные изоэлектрические точки, при определенном значении рН они будут двигаться с различной скоро-стью. Подбирая соответствующие буферные растворы для установления определенной скорости движения и растворимости веществ, можно ис-пользовать электрофорез для их разделения. Метод позволяет разделять вещества, различие в изоэлектрической точке которых составляет до 0,02 единиц рН. Градиент рН в 0,02 единицы часто достигают прибавлением амфолитов, представляющих собой готовую смесь алифатических полиаминаполикарбоновых кислот. Электрофоретическое разделение белков широко используется для оценки качества мяса и мясных продуктов, для дифференцирования вида мяса и рыбы. Метод также применяется для выявления немясных добавок (белков молока, сои, яиц) в мясных продуктах. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле можно охарактеризовать изменение белков в процессе созревания сыров (рис.3.5.2). В настоящее время используют высокоэффективный капиллярный электрофорез, например, для анализа витаминов в диетических продуктах (жирорастворимых А, Е, К, Д; водорастворимых - B1, B2, B6, B12, С, никотинамида); и для определения анионов (сульфат - хлорид-, иодид-) в мо-лочных продуктах.
|
