Общая схема ПЦР

Принцип ПЦР заключается в следующем. Реакционная смесь обычно содержит матричную ДНК, четыре дезоксири-бонуклеозидтрифосфата dATP, dCTP, dGTP и ТТР, Taq-полиме-разу и два синтетических олигодезоксирибонуклеотидных прай-мера длиной 15-30 нуклеотидов, комплементарных участкам противоположных цепей ДНК, фланкирующих исследуемый участок ДНК-матрицы. ПЦР начинается с кратковременного (1-2 мин) прогревания реакционной смеси при ~95°С. При этом происходит плавление цепей ДНК и инактивация примесных белков, которые могут присутствовать в реакционной смеси, если используется недостаточно очищенная ДНК, например, из клинических образцов. Далее реакционную смесь охлаждают до те­пературы отжига праймеров с матричной ДНК (37-65°С). В результате праймеры связываются с комплементарными местами на матрице и с этого момента начинают служить затравками для синтеза Taq-полимеразой новых цепей ДНК, комплементарных каждой из цепей денатурированной матричной ДНК. Для проведения синтеза ДНК в оптимальных для Taq-полимеразы условиях температуру реакционной смеси поднимают до 72°С и при такой температуре проводят элонгацию цепей вновь синтезирующейся ДНК в течение 0,5-2 мин. По окончании стадии синтеза ДНК заканчивается первый цикл ПЦР, после чего проводятся такие же второй, третий и последующие циклы в автоматическом режиме. После завершения третьего цикла уже образуется дискретный продукт ПЦР - фрагмент дцДНК, содержащий на своих 5'-концах последовательности нуклеотидов праймеров. Количество продукта ПЦР в реакционной смеси после завершения каждого цикла удваивается и, следовательно, по мере прохождения реакции экспоненциально возрастает, достигая нескольких микрограммов в реакционной смеси объемом 25-50 мкл. В финале ПЦР содержимое реакционной смеси анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия, где продукт реакции выявляется в УФ-свете. Продукт ПЦР можно выделить из агарозного геля в чистом виде и работать с ним как с обычным фрагментом дцДНК, т.е. гидролизовать рестриктазами, клонировать в плазмидных векторах по липким и тупым концам, секвенировать или использовать в качестве зондов при гибридизации.

С помощью ПЦР можно амплифицировать in vitro сегменты ДНК длиной от 0,1 до 5-7 т.п.о. и более, а для получения положительного результата достаточно присутствия в реакционной сме­си одной-двух копий амплифицируемой последовательности нуклеотидов (например, геномной ДНК, содержащейся в одной-двух соматических клетках). При этом теоретически нет необходи­мости в тщательной очистке матрицы, так как большинство находящихся в реакционной смеси белков и ферментов инактивируется в первых же циклах ПЦР и не оказывает влияния на проте­кание реакции при высоких температурах.

Механизм ПЦР

Компоненты реакционной смеси

Для проведения ПЦР необходимо наличие в реакционной смеси ряда компонентов:

1. ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

2. Два праймера (или несколько – в зависимости от вида ПЦР), комплементарные концам требуемого фрагмента.

3. Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

4. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

5. Ионы Mg²⁺, необходимые для работы полимеразы.

6. Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий:

1. Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C

2. Отжиг.

3. Элонгация (синтез).

"Эффект плато".

Следует заметить, что процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает. Это связано с так называемым "эффектом плато". Термин "эффект плато" используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0,3-1 пмолей. В зав-сти от условий и кол-ва циклов реакции амплификации, на момент достижения "эффекта плато" влияют:

1. Использование и истощение компонентов реакции (dNTP, праймеров, исходной ДНК);

2. Сокращение эффективности денатурации двухцепочечных матриц;

3. Неэффективность отжига праймеров;

4. тепловая инактивация и /или уменьшение концентрации фермента;

5. Накопление конечных продуктов реакции (пирофосфата, олигонуклеотидов);

6. Переассоциация продуктов реакции и/или исходных компонентов реакции;

7. Образование неспецифических продуктов, конкурирующих за исходные компоненты реакции со специфическими продуктами.

Чем меньше начальная концентрация ДНК-мишени, тем выше риск выхода реакции на плато. Этот момент может наступить до того, как количество специфических продуктов амплификации будет достаточно, чтобы их можно было проанализировать. Избежать этого позволяют лишь хорошо оптимизированные тест-системы.

Стадии постановки ПЦР:

1. Подготовка пробы биологического материала - Способ выделения ДНК зависит как от вида определяемого возбудителя, так и от вида клинического образца. В случае соскоба эпителиальных клеток, клеточного осадка мочи широкую распространенность получил метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении лизирующего агента, содержащего раствор гуанидина, сорбции ДНК на сорбенте, многократной отмывки и ресорбции ДНК буферным раствором. В случае обработки сыворотки, плазмы или цельной крови обычно используется метод фенольной экстракции. Метод включает депротеинизацию фенолом/хлороформом с последующим осаждением ДНК (или РНК) этанолом или изо-пропанолом.

2. Амплификация

3. Детекция - Амплифицированный специфический фрагмент ДНК выявляют методом электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением с длиной волны 290-330 нм.

3.1. Метод горизонтального электрофореза (в агарозе)

3.2. Метод вертикального электрофореза (в полиакриламидном геле)

Контроль за прохождением реакции амплификации

Положительные контроли - в электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю, должна присутствовать оранжевая светящаяся полоса. Ее электрофоретическая подвижность должна соответствовать указанной в инструкции длине ампликона.

Отрицательные контроли - наличие такой полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации

Внутренние контроли - В последнее время в коммерческие тест-системы вводят внутренний контроль, дающий на электрофореограмме отдельную полосу. Применение внутреннего контроля позволяет исключить получение ложноотрицательных результатов вследствие присутствия ингибиторов реакции.

Методы ПЦР