Мультипраймерная ПЦР

Под мультипраймерной (мупьтиплексорной) полимеразной цепной ре­акцией принято понимать процесс коамплификации нескольких ДИК-мат­риц в одной реакционной среде с использованием нескольких пар прай­меров, что позволяет проводить скрининг сразу по нескольким инфекци­онным возбудителям, определять одновременно наличие в биопробе ком­плекса факторов вирулентности и резистентности к антибактериальным и противовирусным препарагам, а также исследовать состояние нескольких аллельных генов у эукариотических организмов, включая человека.

Модификации метода полимеразной цепной реакции ОТ-ПЦР

Гнездовая ПЦР (nested PCR)

Механизм простой полимеразной реакции не пригоден для иденти­фикации рибонуклеиновых кислот, так как Таq-полимераза не способна катализировать синтез ДИК на матрице РИК. Вместе с тем хорошо изве­стно, что геномы многих вирусов состоят из молекул рибонуклеиновой кислоты (РИК) и, вследствие этого, идентификация РИК вирусов, таких как вирус гепатита С, прсдставляется актуальной задачей. Практичсски это решается с помощью нескольких приемов.

1. Использование дополнительного фермента - РИК-зависимой ДИК полимеразы- обратной транскриптазы ОТ (RT - reverse transcriptase). Реакция, катализируемая этим ферментом, приводит к образованию од­нонитевых фрагментов ДИК, используемых в дальнейшем в амплифи­кации с помощью Тао-полимеразы.

2. Как уже было отмечено выше, Таq-полимераза не способна катали­зировать процесс обратной траскрипции, то есть сиитез однонитевой ДИК на РНК-матрице.

Одной из распространенных модификаций метода ПЦР является ис­пользование двух пар праймеров, одна из которых способна амплифици­ровать внутренний участок ампликона, полученного после первого ра­унда амплификации с внешней парой праймеров, Существует несколько вариантов применения гнездовой ПЦР в лабораторной диагностике.

1. Согласно первому варианту проводится амплификация (15-30 циклов) с внешней парой праймеров, при этом амплифицируется основной фраг­мент ДИК Далее часть содержимого переносится в новую пробирку, содер­жащую реакционную смесь, в состав которой входит пара праймеров, узна­ющая последовательности, лежащие внутри основного ампликона. Второй раунд амплификации (реамплификации) также составляет 15-30 циклов.

2. Во втором варианте температура отжига внутренней пары прайме­ров подбирается с таким расчетом, чтобы при проведении первого раунда амплификации они не участвовали в реакции. Обычно температура отжи­га праймеров в этом вариаите гнездовой ПЦР подбирается на 1 0-15°С ниже, чем для внешней пары праймеров, Программа амплификации в этом случае состоит из двух программных блоков. После про ведения первого про­граммного блока амплификации температура отжига праймеров для вто­рого раунда задается на 1 О градусов ниже. Это обеспечивает эффективное участие внутренней пары праймеров во втором раунде амплификации.

Применение гнездовой ПЦР имеет свои преимущества и недостатки. Во-первых, это высокая чувствительность методики. Во-вторых, проведение гнездовой амплификации отменяет необходимость исполь­зовать другие методы, подтверждающие специфичность реакции. Кро­ме того, перенос продуктов реакции из одной пробирки В другую су­щественно снижает концентрацию ингибиторов, которые могут при­сутствовать в пробе после выделения нуклеиновых кислот.

Однако несмотря на ощутимые преимущества, перенос ампликона из одной пробирки В другую может приводить к появлению большого количества ложноположительных результатов вследствие перекрест­ной контаминации проб продуктами амплификации.

In Situ ПЦР Метод In Situ (IS)- ПЦР стал активно развиваться в последнее время благодаря тому, что он, в отличие от ПЦР, проводимой В растворе, позволя­ет не только специфически амплифицировать какую-либо последователь­ность дик, но и локализовать ее внутри клетки. Метод характе­ризуется такой же высокой чувствительностью, как и ПЦР, проводимая в растворе (возможность амплификации исходно одной копии ДИК-мише­ни). Способность локализовать специфическую последовательность де­лает IS-ПЦР неоценимым как в исследовании латентных вирусных инфек­ций и экспрессии генов в клетке, так и в оценке эффекта действия новых лекарственных средств на клеточном и молекулярном уровне.

Внутриклеточное обнаружение продуктов ПЦР может осуществлять­ся двумя способами: через опосредованную (непрямую) In Situ гибри­дизацию или прямую детекцию меченых нуклеотидов (например, ди­гоксигенин-ll-дУТФ, флуоресцеин-дУТФ), которые включаются в со­став амплифицируемого продукта в процесс е ПЦР (прямая IS-ПЦР). В непрямом методе гибридизация меченой ДИК-пробы с амп­лифицированным продуктом обеспечивает максимальную специфич­ность при внутриклеточной детекции ПЦР-продуктов.

Мы бы хотели остановиться на некоторых особенностях проведения IS ПЦР. В первую очередь это касается протеолитической обработки гистологических срезов или клеточного монослоя. Высокая концентрация протеолитических ферментов (трипсин, пепсин или протеиназа К), или длительное время инкубации с ними часто приводят к искажению мор­фологической картинЫ препарата низкие концентрации - к недоста­точному протеолизу и, как следствйе этого, к низкой проницаемости клеточной мембраны дЛЯ ПЦР. При проведении IS-ПЦР также учитывается возможность получения как ложноположительных, так и ложноотрица­тельных результатов. Первая группа артефактов ВКЛючает в себя ампли­фикацию неспецифической ДНК в результате ПЦР, неспецифическое включение меченого нуклеотида вследствие репаративных свойств ДНК­полимеразы клетки или используемой в реакции Таq-полимеразы, диф­фузию амплифицированных фрагментов ДНК из клеток. Вторая группа артефактов (ложноотрицательные результаты) особенно характерна дЛЯ IS-ПЦР, выполненной на стекле. Их причина до конца не выяснена, но возможно уменьшение эффективности амплификации обусловлено фи­зическими факторами, такими как недостаточно быстрое охлаждение и нагревание препарата, недостаточная конвекция реагентов под зажима­ми или возможная адсорбция ДНК-полимеразы и других компонентов на поверхности стекла, покрытой специальным агентом. Альтернатив­ное объяснение ложно-отрицательных результатов - это потеря ПЦР-про­дуктов во время промывок препарата при детекции, Чтобы избежать ложноотрицательных и ложноположительных ре­зультатов обычно выполняют следующие контроли: обработка срезов или клеточного монослоя ДНК-азой (отрицательный контроль), прове­дение амплификации ДНК без ДНК-полимеразы; проведение амплифи­кации ДНК без праймеров (контроль ДНК-полимеразной репарации), про ведение процедуры выявления без использования антител, а также без использования щелочной фосфатазы - для регистрации содержания эндогенного биотина и эндогенной активности фермента (если в каче­стве меченого нуклеотида используется биотин -11-дУТФ).

Количественная ПЦР Существует несколько приемов для количественной оценки продуктов амплификации, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.

Вначале необходимо получить представления о том, какие причины могут влиять на точность измерения ампликонов и что такое количествен­ная ПЦР. Как и любая биохимическая реакция, протекающая in vitro, ПЦР имеет ряд существенных отклонений от теоретически предсказанной за­кономерности накопления продукта, ПРОисходящего не по закону гео­метрической прогрессии, а по сложному закону, обусловленному исто­щением реагирующих компонентов, присутствием ингибиторов, инак­тивацией фет-мента в ходе реакции и т.д. Принять во внимание все эти факторы при расчете калибровочных кривых практически невозможно, поэтому необходимо применение методик, позволяющих учитывать мно­гочисленные параметры в ходе самой ПЦР. Исследователь не может быть до конца уверен в том, что все испытуемые образцы при изначально оди­наковых условиях по реагентам и температуре в термобпоке дают одина­ковый выход продукта. Из вышесказанного следует, что действенным способом борьбы с недостатками ПЦР как метода количественного оп­ределения мишеней амплификации являются методические приемы, по­зволяющие регистрировать протекание реакции или вносить поправки, выявляя возможные артефакты в каждой пробе. Для создания количественной ПЦР наиболее распространены подхо­ды, использующие внутренние контроли- стандарты, которые, как и оп­ределяемая ДНК, участвуют в ПЦР. Используя контроли -стандарты с разным количеством копий на образец, можно определить количество копий матрицы, участвующей в реакции. Внутренний контроль­ стандарт выполняет несколько функций. Во-первых, он позволяет выя­вить возможное ингибирование реакции ингибиторами, содержащимися в выделенном клиническом образце. Во-вторых, использование контро­ля в ходе реакции в той же пробирке, где происходит определение испы­туемой матрицы, позволяет учесть эффект неравномерности протекания реакции, так как условия амплификации стандарта и определяемой ДНК или РНК абсолютно идентичны. В третьих, использование контроля по­зволяет в значительной степени абстрагироваться от изучения законо­мерностей протекания реакции, так как основным алгоритмом опреде­ления является совпадение интенсивности сигнала от внутреннего конт­роля-стандарта и сигнала от определяемого ампликона. Кроме описанного выше метода количественной ПЦР с использова­нием внутреннего контроля на пракгике используется еще один прием, по­лучивший название "метод конечных разведений". cyrь подхода в том, что определяется конечное разведение образца дик или РНК, дающее поло­жительный результат ПЦР. В каждом определении используется панель стан­дартов для выявления чувствительности работы тест-системы. Этот метод не дает реальной возможности контролировать процесс амплификации со всеми его отклонениями от ожидаемого, вместе с тем, техника его наиболее проста в исполнении. Из-за методической простоты некоторые лаборатории до сих пор используют этот метод для так называемых внут­рилабораторных (in house) технологий. Такой подход неприемлем для отечественной лабораторной службы, строго регламентирующей возмож­ность работы только с сертифицированными наборами реагентов.

Область применения метода ПЦР в клинической диагностике:

- ранняя диагностика инфекционных заболеваний у серонегативных пациентов, когда лечение наиболее эффективно;

- выявление персистирующих, латентных и рецидивирующих форм инфекций;

- контроль проведения лечения;

- диагностика оппортунистических инфекций, часто протекающих на фоне иммунодефицита, вследствие чего постановка диагноза только по результатам серологических исследований затруднена, из-за имеющихся несоответствий между параметрами иммунного ответа и течением заболевания;

- уточнение сомнительных результатов серологических исследований;

- эпидемиологические исследования;

- выявление наиболее патогенных штаммов инфекционных агентов;

- исследования инфекционности пулированных образцов крови и ее продуктов, применяемых в клинике;

- определение резистентности к лекарственным препаратам.

Методы ДНК-диагностики незаменимы в пренатальной диагностике наследственных заболеваний (муковисцидоза, фенилкетонурии, гемофилии и пр.), а также при установлении отцовства.