Методы обнаружения антигенов и антител

Первый этап взаимодействия антигена с антителом сам по себе не имеет видимых проявлений. Для его обнаружения используют разного рода метки (флюоресцентные красители, ферменты, изотопы и др.). Обычно метят антитела; при их связывании с материалом, содержащим антиген (клетками, веществами, фиксированными на носителе и др.), на нем удается обнаружить метку. Этот подход лежит в основе разнообразных тестов, широко используемых в исследовательской и клинико-лабораторной практике. Традиционно его комбинировали с гистологическим или электронно-микроскопическим исследованием фиксированного биологического материала (срезов). В последние годы широкое распространение получило определение мембранных молекул клеток с помощью моноклональных антител, меченных флюорохромами; определение в этом случае осуществляют методом проточной цитофлюорометрии. Созданы новые высокочувствительные методы регистрации связывания антигенов антителами, фиксированными на поверхностях, в основу которых положена оценка трансформации энергии связывания в физические сигналы (биосенсорные системы).

Другая группа методов основывается на оценке второго этапа реакции антиген — антитело, проявляющегося в образовании иммунного комплекса с разнообразными физико-химическими и биологическими последствиями. Основное из этих проявлений — формирование преципитата. Еще в те времена, когда структура антител и их валентность были неизвестны, анализ реакции преципитации (количественная преципитация по Гейдельбергеру, позволил сформулировать основные иммунохимические закономерности. Реакция количественной преципитации послужила важнейшим источником информации о свойствах антител, когда иные методы их изучения были недоступны.

Тогда же была создана теория решетки, согласно которой в основе формирования преципитата лежат бивалентность антитела и поливалент­ность антигена. В результате при взаимодействии антигена с малым ко­личеством антител формируются комплексы из одиночных пар молекул. Эти комплексы растворимы. По мере увеличения количества антител возникает возможность не только каждой молекуле антитела связывать две молекулы антигена, но и разным молекулам антитела взаимодействовать с одной молекулой антигена. В результате формируется молекулярная решетка, не способная «удержаться» в растворе и формирующая преципитат. Размер решетки и объем преципитата увеличиваются с нарастанием дозы антител (при постоянной концентрации антигена). В зоне эквимолярных соотношений (когда в жидкости над преципитатом не удается обнаружить ни антигена, ни антител), а также при некотором избытке антител объем преципитата максимален. Дальнейшее добавление антител приводит к своеобразной блокаде молекулы антигена: антиген оказывается связанным с обеими валентностями нескольких антител. Это препятствует формированию решетки и сопровождается образованием относительно небольших растворимых комплексов состава Ag4Ab3, Ag3Ab2 или Ag2Ab. Такие представления в основном подтвердились, хотя и были уточнены во многих деталях.

 

В настоящее время методы, основанные на преципитации, продолжа­ют использоваться в экспериментальной и клинической иммунологии. Примером может служить метод радиальной диффузии, позволяющий оценивать концентрацию антигена по радиусу кольца преципитации. Кольцо формируется при диффузии антигена из лунки в агар, содержащий антитела. На иммунопреципитации основаны многие современные методы иммунохимического анализа, например осаждение моноклональными антителами клеточных лизатов с последующим электрофоретическим анализом преципитированного материала. Преципитация лежит в основе широко распространенного в настоящее время метода иммуноблоттинга («иммунопромокания»), при котором комплекс белков разделяют электрофоретически, переносят в целлюлозу и «проявляют», осаждая антителами. В обоих этих случаях удается определить молекулярную массу изучаемых молекул и другие их свойства.

 

Другой подход к регистрации реакции антиген — антитело основан на феномене агглютинации. Его сущность в том, что при взаимодействии час­тиц (в том числе клеток, например, эритроцитов), суспендированных в рас­творе, с антителами происходит перекрестное связывание, которое приводит к формированию агрегатов частиц. Стабильность суспензии частиц, поддерживаемая их взаимным электростатическим отталкиванием, наруша­ется, и формируется агглютинат, обнаруживаемый визуально. В реакции агглютинации используют как нативные клетки, так и клетки (или другие частицы), нагруженные антигенами (непрямые варианты метода).

Практ.прим.РА

1. Идентификация штаммов Е.coli, сальмонелл, бруцелл с прим. моноспецифических сывороток

2. Обнаружение специфических антител в сыворотке крови

 

Третий подход к выявлению второй фазы взаимодействия антиген — антитело основан на лизисе клеток, с поверхностью которых связались антитела, в присутствии комплемента. Для осуществления реакции лизиса требуется перекрестное сшивание антителами мембранных молекул. Этот подход лежит в основе реакций гемолиза и лимфоцитотоксичности.

Заключение

Степень пространственного соответствия детерминантных групп антигена (эпитопов) и активного центра антител обусловливает силу их взаимодействия, мерой которой является аффинность (сродство). Реакция антигенов и антител приводит к формированию иммунных комплексов и сопровождается изменением физико-химических свойств компонентов реакции, что используют в иммунологических методах.