Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1 Объекты исследования микробной деградации в пресной воде

 

Объектом исследования в настоящей работе были пресноводные тропические бактерии, обладающие способностью к биодеградации ПГА.

Материалом для исследования служили образцы полигидроксиалканоатов (ПГА) двух типов – гомополимера 3­гидроксимасляной кислоты (П3­ГБ) и сополимера 3-­гидроксимасляной и 3­гидроксивалериановой кислот (­П3ГБ/3­ГВ), имеющие близкие физико-химические свойства. Образцы помещали в чехлы из мелкоячеистого мельничного газа и погружали на глубину 0,3-0,5 м в искусственный водоем на климатической испытательной станции (г. Нячанг, Вьетнам) (Рисунок 1).

Рисунок 1 - Размещение чехлов с образцами полимеров

Морская научно-исследовательская и испытательная станция (МНИИС) «Дам Бай» расположена на острове Че в заливе Дам Бай (12º 14' с.ш., 109º 11' в.д.). Удалённость от моря ≈ 50 м. Является береговой и надводной станцией и занимает по площади 2 га на суше и 1,7 га морской акватории.

 

 

Таблица 1 – Гидропараметры пресной воды в бассейне с биополимерами

Дата	Температура	Кислород	pH	Соленость
06.12.2011	24,3	1,6	7,9
16.12.2011	24,1	1,9	7,4
13.01.2012	23,4	2,4	7,5
06.02.2012	24,7	0,9	7,0

 

Образцы экспонировали в воде в течение 1 года (январь 2011 – февраль 2012 г.) Для выявле­ния микроорганизмов­-деструкторов ПГА высевали соскоб с поверхности полимеров на специализированную питательную среду. Посев производили в трехкратной повторности с использованием разведений 10 – 10⁵. Чашки с посевами выдерживали при температуре 28-30°С, анализ посевов проводили на 5-7 сутки культивирования.

 

2.2 Объекты исследования микробной деградации в почве

Материалом для исследования являлась почва, взятая из прикорневой зоны лиственницы (Larix sibirica L.), в которую размещали полимерные пленки из гомополимера (П3ГБ) и сополимера поли-3-гидроксибутирата с 3-гидроксигексаноатом (П3ГБ/3ГГ). Объектом исследований служила микрофлора, выделенная из этой почвы. Эксперимент проводился на территории дендрария Института леса СО РАН им В.Н. Сукачева.

Для изучения процессов биодеструкции ПГА в почве, образцы полимеров в виде пленочных дисков массой 60±6.5 мг (диаметр 30 мм, толщина 80±7 мкм) в нейлоновых сетчатых контейнерах, размещали в почве на глубине 5 см в прикорневой зоне лиственницы (Larix sibirica L.) (рисунок 2).

Рисунок 2 - Полимерные образцы 3ГГ и 3ГБ заложенные в почву

 

Эксперимент проведен в течение полевого сезона 2012 года в период с 23 мая по 4 ноября. Выявление микроорганизмов-деструкторов ПГА проводили в четыре этапа через 1 месяц экспонирования. Для этого из биопленки, сформированной на поверхности полимера, методом соскоба были взяты микробиологические пробы, которые высевали на специализированную питательную среду. В работе использовали разведения 10⁵ – 10⁸. Чашки с посевами выдерживали при температуре 30°С. Эксперименты проводили в 3-х кратной повторности.

 

2.2.1 Основные характеристики почвы дендрария

Биодеградацию ПГА исследовали в реальных природных условиях, в почве дендрария Института леса СО РАН. Сотрудниками Института леса СО РАН исследованы основные характеристики почвы дендрария и показано, что эта почва характерна для дерново-карбонатного типа. Этот тип почвы сформирован на известняках и других карбонатных почвообразующих породах под хвойными, лиственно-хвойными и широколиственными лесами. Профиль почвы состоит из гумусового горизонта мощностью от 10-15 до 30-40 см и подстилающей его карбонатной породы, окрашен в тёмно-серый цвет. Характерные свойства почвы дендрария - слабощелочная или близкая к нейтральной реакция гумусового горизонта (7,08±0,08), невысокое содержанием гумуса – (2,55±0,13%), полная насыщенность поглощающего комплекса основаниями (Са и Mg), отсутствие дифференциации профиля по механическому составу, водопрочная зернистая и ореховато-зернистая структура, высокая биологическая и микробиологическая активность, значительные запасы питательных веществ (фосфора, калия и азота). Органическое вещество хорошо минерализовано (С:N < 20). В составе поглощающего комплекса преобладает кальций – 20,1±0,5 м-экв/100 г. Перечисленные свойства почвы наиболее устойчивы, вариабильность их по площади участка не значительна: 3,6% по рН, 8,7% - Ca, 15,6% - гумус. Сильно варьирует карбонатность верхнего 40-сантиметрового слоя – коэффициент вариации составляет 52%. Мобильным является и содержание подвижных элементов питания: фосфора и азота. Для почвы питомника характерно повышенное содержание фосфора (58±4,93 мг на кг почвы) и калия (319±8,07 мг на кг почвы) при низкой обеспеченности азотом. Определение нитратного и аммиачного азота в сухих образцах показало, что при невысоком их содержании заметно преобладают аммиачные формы. Количество N-NH₄ одинаково в слоях 0-20 и 20-40 см, тогда как более высокое содержание нитратов приурочено к более гумусированному верхнему слою почвы.

 

2.2.2 Определение активной кислотности почвы прикорневой зоны лиственницы

Для проведения анализа взяли почву из прикорневой зоны лиственницы, просушили ее, затем взвесили 10 г. Поместили почву в колбу емкостью 100 мл, налили 40 мл дистиллированной воды и хорошо перемешали, после чего раствор профильтровали. Отстоявшуюся жидкость осторожно слили в небольшую колбочку и измерили рН данного раствора. рH = 7.5, 7.3.

 

2.3 Определение способности бактерий к биодеградации

Определение биодеструктивной способности микромицетов изучали на среде следующего состава (г/л):

ПГБ - 5,0; NaNO₃ - 2,0; KH₂PO₄ – 1,0; KCl, MgSO₄×7H₂O – 0,5; FeSO₄×7H₂O – 0,01; Пептон – 0,1; Дрожжевой экстракт «Difco» - 0,1; Агар – 20,0. Среда содержала в качестве источника углерода 0,25% порошкообразного полимера (ПГБ).

Рост микроорганизмов, обладающих ПГА­-деполимеразной активностью, сопровождался образованием вокруг колоний на поверхности ага­ризованной среды характерных прозрачных зон (Рисунок 3).

Рисунок 3 - Рост бактерий на среде с ПГА; 1 – деполимеразная активность

 

2.4 Методы идентификации микроорганизмов

Изучение фенотипических признаков микроорганизмов-деструкторов проводили стандартными микробиологическими методами [12,14]. При идентификации бактериальных изолятов проводили сравнительный анализ их морфологических, культуральных, биохимических свойств. Определяли морфологию вегетативных клеток, спорообразование, подвижность, окраску по Граму, каталазную, оксидазную, амилазную, липазную, лецитиназную, левансахаразную и протеиназную активность, образование кислоты из глюкозы, лактозы, сахарозы, мальтозы и маннита, восстановление нитратов и потребность в факторах роста.

Принадлежность изучаемых культур к группе грамположительных или грамотрицательных бактерий определяли экспресс-методом Грезерсона. Клетки культур помещали бактериологической петлей в каплю 3%-го раствора КОН на предметное стекло, размешивали круговыми движениями и через 5-6 секунд петлю резко поднимали. Суспензия грамотрицательных бактерий становилась вязкой и тянулась за петлей, образуя тяжи. Грамположительные бактерии равномерно распределялись в капле щелочи. Реакцию считали отрицательной, если образование слизистых тяжей не наблюдалось в течение 60 секунд.

При изучении физико-химических свойств культур, определяли их способность продуцировать каталазу. С помощью бактериологической петли клетки культур перенесли на предметное стекло. Поместили одну каплю 3% раствора пероксида водорода на материал на предметном стекле. Положительная реакция проявлялась быстрым появлением пузырьков газа. При отрицательной реакции в течение 20 секунд выделение газа не происходило.

Для выявления амилолитической активности использовали среду следующего состава (г/л): пептон – 10.0; КН₂РО₄ – 5.0; растворимый крахмал - 2.0; агар – 15.0; рН среды 6,8 – 7.0. Среду стерилизовали при температуре 121 ºС 30 минут и разлили в стерильные чашки Петри. Исследуемые микроорганизмы высевали штрихом по диаметру чашки. Продолжительность культивирования составила 7 суток, при температуре 30ºС. Гидролиз крахмала обнаруживали после обработки агаровой поверхности раствором Люголя. Для этого на поверхность среды наливали 3-5 мл раствора Люголя, после чего среда окрашивалась в синий цвет, а зоны гидролиза крахмала приобретали красно-бурую окраску (Рисунок 4).

Рисунок 4 - Тест на амилазную активность

 

Так же изучали протеолитическую активность у микроорганизмов. Для этого культуры высевали на мясопептонную желатину (МПЖ). К 100 мл мясопептонного бульона (МПБ) добавили 15 г желатины, оставили на 15 минут, чтобы она набухла, затем нагрели на водяной бане до полного растворения желатины и разлили в пробирки по 10 мл. Стерилизовали при температуре 121 ºС 15 минут. Посев проводили уколом. Продолжительность культивирования составило 10 суток при комнатной температуре. Разжижение желатины отмечали визуально.

Для выявления липазной и лецитиназной активности использовали желточно-солевую среду следующего состава: к 100 мл расплавленного и охлажденного до 60-70 ºС стерильного МПА(pH 7,2), содержащего 10 г NaCl, добавляли 10-20 мл желточной взвеси, перемешивали и разливали в чашки Петри. Исследуемые микроорганизмы высевали штрихом по диаметру чашки. Продолжительность культивирования составила 3 суток, при температуре 27 ºС. Визуально отмечали при лецитиназной активности помутнение снизу колоний, а при липазной активности блестящий налет сверху колоний.

Оксидазную активность выделенных изолятов бактерий определяли с помощью тест-полосок окситест (MIKRO-LA-TEST) (Рисунок 5).

а

б

Рисунок 5 - Оксидазная активность: а – отрицательная;

б – положительная.

 

Способность исследуемых культур ферментировать углеводы изучали на универсальных средах Гисса. В состав этих сред входят: панкреатический гидролизат кильки, индикатор и различные углеводы (глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза, манит). Среду готовили следующим образом – 15 грамм препарата размешивали в 1 литре дистиллированной воды, кипятили до полного растворения. Разлили в стерильные пробирки. Засев проводили уколом, культивировали в течение 3 дней. Визуально отмечали образование газа и кислоты (Рисунок 6).

Рисунок 6 - Рост бактерий на средах Гисса

Потребность в факторах роста бактерий изучали на среде Фратера(г/л): (NH₄)₂SO₄ – 1.0; MgSO₄˟7H₂O – 0.25; водопроводная вода, K₂HPO₄ – 0.1; глюкоза – 10.0; pH= 6.0-7.0. Среду разлить в пробирки по 5мл. Охарактеризовать рост: слабый, умеренный, обильный. Охарактеризовать пленку на поверхности пробирки, встряхнуть и через неделю опять посмотреть пленку, так как после посева с богатой среды идет адаптация к новым условиям.

Для образования левансахаразы изучается на среде с сахарозой и мелом. В состав среды входят дрожжевая вода, сахароза – 5%, агар – 2%, CaCO₃ – 1%, pH = 6.8-7.0. Стерилизовать при 0.5 атм. Посев осушевствляется штрихом на чашки Петри. Образующийся леван представляет собой сиропрастекающуюся массу.

Для восстановление нитратов используют среду Абдельмалека (%): МПБ, глюкоза – 1.0, агар – 0.3, KNO₃ – 1.0, pH = 7.0. Растворить МПБ, глюкозу и KNO_3, довести pH до 7.0 и внести агар. Все это расплавить и разлить в пробирки по 10-12 мл. Засев проводят уколом, после чего заливают голодным агаром. Посев описывают через 5-6 дней или даже позже. Отмечают наличие роста по уколу и наличие полостей между средой и столбиком голодного агара.