Первые фрески появились в соборе через два года после построения храма, в 1481 г.. когда были расписаны алтарная преграда, Петроверигский и Похвальский приделы. В 1513-1515 гг. храм был украшен росписью полностью. ("и совершена подпись достиже месяца августа в 27 день"). Часть росписей 1481 г. дошла до наших дней, фрески же начала XVI века были полностью переписаны в 1642-1643 гг. Однако содержание фресок не изменилось: согласно царскому указу были повторены первоначальные сюжеты фресок, снятые "на образцы".
Успенский собор, будучи кафедральным, с самого начала играл видную роль в идейно-политической жизни Москвы и всего Российского государства. Уже вскоре после его постройки он стал местом коронации русских государей. Здесь в 1498 г. Иван III короновал великим князем внука Дмитрия (сына Ивана Ивановича Молодого и Елены Волошанки) в обход своего старшего сына Василия от Софьи Палеолог. Хотя впоследствии, в самом начале XVI в., Иван III и отстранил Дмитрия от политической жизни, склонившись в пользу Василия, однако разработанный в 1498 г. по византийскому образцу пышный ритуал коронации продолжал существовать, а в дальнейшем лег в основу коронации Ивана IV в 1547 г. царским венцом.
В Успенском соборе происходило и рукоположение митрополитов. Наиболее ранний сохранившийся документальный источник - акт поставления митрополита Иоасафа - датирован 1539 г. В 1589 г. в Успенском соборе константинопольским патриархом Иеремиею был поставлен первый в России патриарх Иов. В Успенском соборе погребены митрополиты и патриархи, за исключением подвергшихся ссылке, лишенных митрополичьего (в дальнейшем патриаршего) престола либо самовольно его оставивших.
Большую часть доходов собора составляли пожертвования, которые делались, в основном, на поминовение своей души. Наиболее ранняя сохранившаяся запись помещена под 7029 (1520) г., когда "преставися раб божий Федор Вепрь Васильев сын Антонова", приказав накануне своей смерти дать в Успенский собор протопопу Афанасию "з братнею" 100 рублей. Поминовение в Успенском соборе было почетным, в Синодик Успенского собора ряд лиц пытались попасть в обход существующих правил. Так в Синодике XVII века на полях сделана пометка проитв рода Андрея Стефанова - "по сих родителех не дано ничего, а поминают даром со 121 году (1613), а записаны за посул (то есть за взятку)". Изменения в Синодике производились и по указанию государя. Клирики Успенского собора в угоду Ивану IV даже пошли на фальсификацию линии престолонаследия, изъяв из него "память" старшему сыну Ивана III от Елены Волошанки велиокому князю Ивану Ивановичу и Дмитрию - внуку. Сделано это было путем подчистки отчества Ивана Ивановича в "вечной памяти" ему: "Благоверному христолюбивому великому князю Иоанну Иоанновичу" и надписи по счищенному - "Васильевичу".
Успенский собор быстро стал довольно крупным землевладельцем. Первые земельные вклады в Успенский собор восходят к концу XV в., когда его земли начали отделяться от земель митрополичьей кафедры. В 1486 г. накануне своей смерти верейский князь Михаил Андреевич дал "к Пречистой к соборной церкви на Москву, протопопу и свещенником, в Ерославском уезде свое село Татаренки в Заечкове со всем, что к тому селу исъстарины потягло по своей души, после своего живота. То им и за годовой поминок". Интересно, что этот вклад был условным - оговаривалось, что если бы Великому Князю потребовалось это сельцо, то он мог забрать его себе, дав протопопу и священникам Успенского собора за него 60 рублей. Впоследствии это сельцо в перечне владений Успенского собора не упоминается, оно или перешло к князю, или запустело.
Помимо прямых земельных вкладов собору жертвовали и деньги, с условием покупки на них земли. По возможности эти условия выполнялись. Так протопоп Евстафий "купил сельцо Ондреяновское с деревнями у Ивана Агарева, а дал на нем двести рублев: сто рублев казенную, а другую сто рублев Мясоедову". Эти сто рублей дьяк Констанин Семенович Мясоед-Вислой дал в Успенский собор в 1569 или 1570 г. к XVII веку условия о покупки земли на вклады исчезают. По всей вероятности из-за закона от 15 января 1580 г., запрещавшего монастырям и церквам приобретать недвижимое имущество.
Стены Успенского собора были свидетелями бурных событий. Во время знаменитого Московского восстания 1547 г. ненавистный временщик дядя царя князь Ю. В. Глинский пытался спрятаться в Успенском соборе. Восставшие посадские люди, по словам Ивана IV в его Первом послании к Курбскому, "изымав его, в пределе великомученика Дмитрия Селунскаго, выволокши, в соборной и апостольской церкви пречистыя богородицы против митрополичья места, безчеловечно убиша и кровию церковь наполниша и, вывлекши его мертва в передние двери церковныя, и положиша на торжише, яко осуженника". Аналогичная версия есть и в приписке к Лицевому своду, посвященной этим событиям.
Собор часто страдал от пожаров. Пытаясь по возможности освободить от лишних нагрузок верхи здания, Аристотель пошел на такой рискованный шаг, как устройство на соборе деревянных кровель, с последующей опайкой их жестью. Кровли были уложены посводно и постоянно худились. Уже в 1493 г. собор дважды зажгла молния. Губительным оказался пожар 1547 года. В нем пострадала западная паперть собора и обгорел колончатый фриз над нею.
