Ускоренные методы диагностики анаэробной газовой инфекции

1. Исследуемый материал засевают в 10 пробирок с полужидкой средой и затем 5 пробирок прогревают при 80⁰С 20 минут для уничтожения вегетативных форм бактерий. После этого в пробирки добавляют различные моновалентные противогангренозные сыворотки. Обнаружение через 10-18 часов микробов в стрептобациллярной форме и роста их изолированными колониями подтверждает соответствие возбудителя типу сыворотки. Диффузный рост и беспорядочное расположение клостридий указывает на несоответствие возбудителя типу сыворотки.

2. Внутрикожная проба на морских свинках. Материал от больного (тканевая жидкость) вводят внутрикожно в область предварительно выбритой брюшной стенки морским свинкам в смеси с моновалентными противогангренозными сыворотками и одному животному без сыворотки (контроль). Наблюдение за животными ведут в течение 24 часов. При нейтрализации токсина, содержащегося в содержимом раны, специфической сывороткой реакция отсутствует. Если сыворотка оказалась неспецифической (как и в контроле), на месте введения материала кожа морских свинок окрашивается в синий или фиолетовый цвет.

Микробиологические методы идентификации микробов
рода Staphylococcus

Целью идентификации является установление рода и вида выделенной чистой культуры. Род стафилококка относится к семейству Micrococcaceae, в которое входят также роды Micrococcus и Planococcus. Общими чертами представителей этого семейства являются: морфология, положительная окраска по Граму; наличие фермента – каталазы.

Род Staphylococcus состоит из нескольких видов, наиболее важными из которых являются S.аureus, S.epidermidis и S.saprophyticus. Представители последних двух видов являются коагулазоотрицательными и долгое время считались непатогенными. В настоящее время доказано, что эпидермальный стафилококк может вызвать такие заболевания, как эндокардит, сепсис, конъюнктивит, инфекция ран и мочевыводящих путей, послеродовые инфекции, а сапрофитический – острый уретрит, цистит и др. На первом этапе устанавливается принадлежность выделенной культуры к семейству Micrococcaceae и роду Staphylococcus. На принадлежность культуры к семейству микрококков указывает положительная проба на каталазу, так как другие кокки (в частности стрептококки), каталазу не образуют. Для установления принадлежности культуры к роду Staphylococcus основными методами являются культуральный и биохимический.

Культуральный метод. Основным отличием стафилококков от микрококков является окраска колоний на плотной среде. Для стафилококков характерна золотистая или белая окраска колоний. У микрококков колонии окрашены в желтый или розовый цвет.

Биохимический метод. Он основан на том, что стафилококки являются факультативными анаэробами, микрококки – облигатными аэробами. В связи с этим стафилококки способны расти и ферментировать глюкозу в анаэробных условиях, а микрококки лишены этой возможности. Для определения этого признака культуру засевают петлёй в столбик полужидкой среды, содержащей 1% глюкозы и индикатор на кислые продукты. Сверху среду заливают стерильным вазелиновым маслом и ставят в термостат при 37⁰С на 5 суток. Рост культуры и изменение цвета среды указывает на принадлежность её к роду Staphylococcus.

Видовая идентификация стафилококков. S.aureus отличается от других видов наличием золотистого или палевого пигмента (в большинстве случаев), наличием ферментов: плазмокоагулазы, лецитиназы (лецитовителлазы) и ДНК-азы. Плазмокоагулазу определяют путём посева культуры в цитратную кроличью плазму, после чего посевы помещают в термостат при 37⁰С и регистрируют результаты через 1, 2, 4, 6 и 18 часов. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка любого размера считается положительным результатом реакции. Лецитиназу определяют путём посева культуры на молочно-желточный солевой агар. В составе яичного желтка имеется лецитовителлин, а наличие молока стимулирует образование пигмента. Посевы выдерживают в термостате при 37⁰С 18-24 часа. О наличии лецитиназы свидетельствует образование вокруг колоний радужного венчика.

Определение ДНК-азы. Принцип метода: под действием ДНК-азы добавленная в плотную среду высокополимерная ДНК распадается на низкополимерные фрагменты. При этом мутная среда, содержащая высокополимерную ДНК, становится прозрачной. Ход исследования: на питательную среду в чашке Петри, включающую от 50 до 200 мг ДНК и 0,5 мл 10% раствора хлористого кальция, штрихами засевают исследуемую культуру и помещают в термостат при 37⁰С на 18-24 часа. После этого на поверхность агара заливают 5-7 мл 3 моль/л раствора соляной кислоты. Если через 2-3 минуты вокруг посевов появляются зоны просветления, то реакция считается положительной

Если культура имеет золотистый (палевый), пигмент, коагулирует плазму и обладает хотя бы одним из двух других ферментов (лецитиназа, ДНК–аза) – её относят к виду золотистого стафилококка. При отсутствии полного набора указанных признаков (основным является наличие плазмокоагулазы) проводят идентификацию видов эпидермального и сапрофитического стафилококков по трем основным признакам, отличающим эти два вида (см. таблицу).

 

Вид стафилококка	Устойчивость к новобиоцину	Фосфатаза	Ферментация маннита
эпидермальный	-	+	-
сапрофитический	+	-	+

 

Устойчивость к новобиоцину определяют путём посева культуры на среду, содержащую 2 мкг/мл новобиоцина. Ферментацию маннита проводят в аэробных условиях путём посева культуры бляшкой на поверхность среды в чашке Петри, содержащей 1% маннита и индикатор на кислые продукты. Появление окрашенных колоний (в цвет индикатора) указывает на способность культуры ферментировать маннит. Таким образом, для эпидермального стафилококка характерны:

- чувствительность к новобиоцину;

- наличие фосфатазы и неспособность окислять маннит.

Для сапрофитического стафилококка характерны противоположные свойства.

Выделенные культуры S.aureus обычно подвергают фаготипированию с международным набором фагов (22 фага). Определение фаготипа стафилококка помогает установить источник инфекции и принадлежность выделенной культуры к госпитальным штаммам.

 

Контрольные вопросы

Опишите по дням ход исследования и результаты при выделении золотистого стафилококка из гноя. Опишите по дням ход исследования и результаты при подозрении на сепсис: сколько крови взять, в какую питательную среду посеять, какое количество питательной среды взять, в каких условиях производится взятие крови и её посев. Дальнейший ход исследования описать отдельно при обнаружении стафилококка и стрептококка. Какие материалы исследуют при подозрении на стафилококковое пищевое отравление, что обнаруживают в исследуемых материалах, на каких животных ставится проба? Идентификация чистой культуры стафилококка: по каким признакам определяют родовую и видовую принадлежность. Методы определения факторов патогенности стафилококка: пламокоагулазы, лецитовителлазы, ДНК-азы. Фаготипирование стафилококков: с какой целью проводится, каким набором фагов, методика фаготипирования. Схема микробиологического исследования при пищевой интоксикации стафилококкового происхождения. Опишите по дням ход исследования и результаты при выделении стрептококка из гноя. Краткая характеристика основных видов из группы грамотрицательных микроорганизмов. Синегнойная палочка: название по–латыни, морфология, культивирование, пигментообразование, основные факторы вирулентности; группы больных, у которых чаще всего наблюдается синегнойная инфекция. Протей: название по-латыни, морфология и физиология, особенности культуральных свойств. Кишечные палочки: наиболее частые формы инфекции (места локализации воспалительных процессов). Характеристика возбудителей анаэробной газовой инфекции (основных трёх видов): название видов по-латыни, морфология (споры, жгутики, капсула). Окраска по Граму, способ биологического окисления, среды для культивирования, характер колоний в толще агара, изменения на среде Вильсон-Блера, изменения на молоке; свойства токсина, действие в организме, серологические типы токсина. Факторы инвазивности. Характеристика неспорообразующих (неклостридиальных) анаэробов. Классификация: семейства, роды, основные виды (названия по-латыни). Основные свойства: морфология, отношение к окраске по Граму, условия культивирования. Ассоциация микроорганизмов (смешанная инфекция) при гнойных и раневых инфекциях: наиболее частые сочетания, особенности микробиологической диагностики при ассоциациях возбудителей.