Встраивания в хромосому реципиента

Самый важной и трудоемкой задачей при создании рекомбинантов является получение нужных генов или фрагментов ДНК для введения в клетки реципиентов. Имеется несколько методических приемов для осуществления этой задачи: синтез генов химическим путем, использование обратной транскриптазы, метод дробовика (дробового ружья).

Синтезгена химическим путем

Впервые был синтезирован ген аланиновой т-РНК дрожжей Кораной в 1969 г. после того, как была расшифрована последовательность нуклеотидов в нем (всего 77 пар нуклеотидов). Сначала синтезировали небольшие фрагменты по 4-13 п.н., а затем сшивали их лигазой. Однако этот ген оказался неактивным, так как не содержал регуляторных элементов.

В 1976 году Корана с сотрудниками добился успеха, синтезировав ген тирозиновой т-РНК кишечной палочки, который уже содержал промотор из 52 п.н., структурную часть из 126 п.н. и терминатор из 121 п.н.. После встраивания в геном мутантного фага Т4 ген заработал как естественный.

Для химического синтеза гена сначала должна быть установлена его первичная структура путем секвенирования (определения последовательности нуклеотидов) ДНК или м-РНК, или с помощью анализа аминокислотного состава кодируемого геном белка. Для установления нуклеотидных последовательностей сейчас существует два подхода – метод Максама и Гилберта, основаный на химической модификации оснований и метод Сенгера на принципе полимеразного копирования с использованием аналогов нуклеотидов для терминации роста цепи. Вхорошо оснащенных генно-инженерных лабораториях имеются специальные приборы – секвенаторы, автоматически определяющие последовательности нуклеотидов в ДНК или РНК.