рекомбинантных клеток

 

После того, как интересующий исследователя ген или фрагмент ДНК был получен (I этап), введен в состав вектора (II этап) и перенесен в клетку реципиента (III этап), возникает довольно сложная задача по идентификации рекомбинантных клеток, которые получили новую генетическую информацию вместе с привнесенным вектором.

Сначала осуществляют клонирование векторной ДНК в клетках реципиента. Для этих целей наиболее часто испльзуют микроорганизмы (бактерии и дрожжи), которые очень быстро размножаются и при этом не только способствуют размножению (амплификации) векторной ДНК, но и эффективно обеспечивают экспрессию встроенных генов и накопление конечных продуктов. Например, с помощью такой технологии в клетках кишечной палочки или дрожжей были получены человеческий инсулин, гормон роста, соматостатин, интерферон и многие другие ценные продукты. Однако в культуре реципиента не все клетки будут нести встроенный вектор, а только их незначительная часть – обычно от 0,0001 до 1%. Поэтому необходимо идентифицировать рекомбинанты с вектором и отделить их от остальных клеток. Для этого наиболее часто используются следующие группы методов:

1) микробиологические методы – отбор по селективным генетическим маркерам;

2) молекулярно-генетические методы;

3) иммунологические методы.

Рассмотрим эти методы и подходы.

Микробиологические методы отбора рекомбинантов прежде всего базируются на том, что в состав вектора вводятся селективные маркеры, например, гены устойчивости к антибиотикам, гены синтеза какого-либо ростового фактора – ауксина, гены синтеза пигмента. Эти селективные маркеры представляют собой своеобразные «метки», по которым можно обнаружить колонии рекомбинантных микробов. Например, в качестве вектора, использовали хорошо известную плазмиду pBR 322, в составе которой имеются два селективных маркера – гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину. С помощью рестриктазы BamH1 разрезали вектор в области гена устойчивости к тетрациклину и в этот сайт встроили ген человеческого инсулина. Следовательно, такой рек-вектор сохранит в действующем виде только один селективный маркер – ген устойчивости к ампициллину. Если исходная культура реципиента – E. сoli – не обладает устойчивостью ни к одному из данных антибиотиков, то при приобретении «холостого» вектора она станет устойчивой сразу к двум антибиотикам (тетрациклину и ампициллину). А при получении рек-вектора с геном инсулина клетки реципиента приобретут устойчивость только к ампициллину, так как при встраивании гена инсулина в плазмиду второй селективный маркер был разрушен рестриктазой.

Как же технически отбирают нужные клетки? Сначала трансформированную векторами культуру высевают в чашки Петри со средой, содержащей только ампициллин. При этом на поверхности агара вырастают только рекомбинанты – и получившие «холостой вектор», и получившие вектор с геном инсулина, так как и те и другие с векторной плазмидой получили ген устойчивости к ампициллину. Не получившие вектор клетки не вырастают на среде с антибиотиком. Затем с помощью специального приспособления – штампа, обтянутого бархатом или другим ворсистым материалом, делают отпечаток (метод реплик) с первой чашки Петри и переносят выросшие колонии на вторую чашку с двумя антибиотиками - тетрациклином и ампициллином. На этой чашке вырастают клетки только с «пустыми векторами», сохранившие гены устойчивости сразу к 2-ум антибиотикам. Сравнивают колонии, выросшие на двух чашках. Те из них, которые выросли на среде с ампициллином, но не выросли на среде с двумя антибиотиками, и будут рекомбинантами, так как ген устойчивости к тетрациклину они потеряли в процессе встраивания гена инсулина, а ген устойчивости к ампициллину сохранили.

Если в составе вектора имеется ген ауксина (например, обеспечивающий синтез треонина), а клетки реципиента по этому признаку являются ауксотрофными, то есть не могут сами синтезировать данную аминокислоту, то образовавшиеся прототрофные рекомбинанты легко можно обнаружить при посеве трансформированной культуры на бедную среду, не содержащую треонина. На такой среде вырастут только те рекомбинанты, которые приобрели вектор. Причем, чем ближе в векторе будут расположены встроенный ген и ген селективного маркера (синтеза треонина), тем больше вероятность корреляции этих двух свойств.

Селективный маркер пигментообразования может использоваться для обнаружения рекомбинантов среди микроорганизмов, но чаще используется для выявления рекомбинантных (трансгенных) растений. Например, если вектор в качестве селективного маркера содержит ген синтеза хлорофилла, а у использующихся растительных клеток-реципиентов синтез хлорофилла нарушен, то после трансформации вектором окраска листьев у рекомбинантного растения восстанавливается. С помощью генно-инженерных методов в растения можно ввести гены устойчивости к гербицидам, засолению, заморозкам, гены устойчивости к насекомым-вредителям и т.д..

Молекулярно-генетические методы базируются на способности одноцепочечной ДНК к гибридизации, т.е. к слиянию с комплементарной одноцепочечной ДНК. При этом частичная гибридизация может происходить, если две цепи не полностью идентичны, а имеют близкие по составу последовательности – гомологичные. Для обнаружения рек-ДНК используют специальные ДНК-зонды, меченные радиоактивными или флюоресцентными метками. ДНК-зонды – это и есть меченная ДНК, способная гибридизироваться с нужным встроенным геном. Подобные методы используются в разных модификациях и получили широкое распространение.

С помощью ДНК-зондов можно находить нужные колонии рекомбинантов прямо на чашках Петри. Сначала колонии на чашках обрабатывают ферментами (например, лизоцимом), чтобы гидролизовать клеточные стенки микробов, затем делают отпечаток колоний на нитроцеллюлозном фильтре. Фильтр обрабатывают раствором ДНК- или РНК-зонда, меченного радиоактивным фосфором, после чего благодаря методу радиоавтографии обнаруживают места расположения колоний рекомбинантов, которые хорошо гибридизируются с зондами. Метод радиоактивных зондов используют не только для выявления колоний, но и для обнаружения нужного гена или фрагмента ДНК при электрофоретическом разделении продуктов рестрикции.

Можно идентифицировать гены на целых хромосомах (метод in situ). Для этого радиоактивный ДНК-зонд (или зонд с флюоресцентной меткой) наносят на препарат хромосом и сверху накладывают фотоэмульсию. Препараты экспонируют в темноте и проявляют. Участки гомологичные зонду будут проявляться в виде черных точек.

Иммунологические методы благодаря высокой чувствительности нашли широкое применение в генной инженерии. Они основаны на специфической реакции антиген-антитело. Для этого сначала получают моноспецифические (моноклональные) антитела к белковому продукту встроенного гена. Чашку Петри с выросшими колониями рекомбинантов обрабатывают ферментами для удаления клеточной стенки, а затем инкубируют с антителами. Вокруг рекомбинантных колоний появляются кольца иммунопреципитации. Если использовать антитела с радиоактивными или флюоресцентными метками, то реакция обнаружения рекомбинантов становится еще более чувствительной и наглядной.

Применение каждого из описанных методов требует высокой квалификации исследователей, высококачественных реактивов и оборудования.

Кроме описанных выше, в генной инженерии используются и целый ряд других методов, которые различаются в зависимости от используемых векторов, способов получения генов для встраивания, использующихся реципиентов и т.д.