Использование обратной транскриптазы

Задача синтеза гена значительно упростилась с открытием фермента обратной транскриптазы, обнаруженной впервые у РНК-содержащих ретровирусов. Ретровирусы используют обратную транскриптазу для синтеза ДНК-овой копии собственной РНК. Образующаяся при этом двухцепочечная молекула ДНК может легко интегрироваться в геном клетки-хазяина. В 1970 г. Темин и Митузани и независимо от них Балтимор выделили данный фермент из препарата внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. По механизму действия этот энзим является РНК-зависимой ДНК-полимеразой, но чаще используются его тривиальные названия – обратная транскриптаза или ревертаза.

Обратная транскриптаза обладает по крайней мере тремя ферментативными активностями:

1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК;

2) Активностью РНК-азы Н, гидролизующей цепь РНК в составе гибрида РНК-ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;

3) ДНК-эндонуклеазной активностью.

Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза очевидно участвует в интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина.

В генной инженерии обратную транскриптазу используют для получения ДНК-овой копии гена, если удается выделить из донорной клетки соответствующую гену m-РНК (матричную, информационную РНК).

Синтез гена с помощью ревертазы ведут таким образом: сначала в систему вводят m-РНК, набор ДНК-овых нуклеотидов, небольшие затравки для синтеза – праймеры – олиго (dT) и обратную транскриптазу, которая начинает синтезировать на матрице m-РНК комплементарную цепь ДНК; затем с помощью щелочного гидролиза удаляют m-РНК, а обратная транскриптаза «делает разворот», и используя только что образованную цепь ДНК как матрицу, синтезирует на ней еще одну комплементарную цепь. Для ускорения синтеза второй цепи ДНК на этой стадии иногда добавляют ДНК-полимеразу I E. coli, которая дублирует полимеризующую активность ревертазы. По окончании синтеза первая и вторая цепи ДНК оказываются связанными петлей в виде шпилечной структуры. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S 1, которая способна специфически гидролизовать одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. В результате получают полноценную ДНК-овую копию гена, которую можно легко встроить в вектор и ввести в клетку-реципиента.

Однако при использовании ревертазы есть свои сложности. Так, m-РНК не содержит регуляторных участков (промоторов и терминаторов), что вызывает необходимость достраивать их в векторе. Кроме того, выделить m-РНК в чистом виде достаточно сложно.

Метод дробовика (дробового ружья)

При невозможности синтезировать ген химическим путем или с помощью обратной транскриптазы используют технику Shot-gun – метод дробового ружья. Суть его заключается в том, что сначала ДНК дробят на фрагменты с помощью рестриктаз, то есть создают библиотку генов или фрагментов ДНК. Полученные ДНК-овые фрагменты гибридизируют «вслепую» с вектором, разрезаным той же рестриктазой. Гибридные векторы, содержащие встроенный ген методом трансформации переносят в бактерии (обычно в кишечную палочку) и размножают. Затем идентифицируют и отбирают необходимые колонии одним из перечисленных ниже методов (см. IV этап). Способ отбора на селективных средах осуществляют с помощью генетических маркеров – способности расти на средах с антибиотиком, если ген несет фактор устойчивости, неспособности расти на средах с антибиотиком, если ген устойчивости к этому антибиотику инактивирован путем встройки в него гибридного фрагмента (при этом используется метод реплик), способности расти на средах без ауксина, если в геном ауксотрофа по этому ауксину введен нужный ген. Если же соответствующий генетический маркер не найден, используют метод гибридизации.