III этап. Введение рекомбинантного вектора в клетку реципиента

После того, как в структуру вектора был включен нужный ген или фрагмент ДНК, возникает задача введения этого вектора в клетку реципиента, который смог бы продуцировать вещество, кодируемое встроенным геном. В качестве реципиента в зависимости от целей экспериментатора могут использоваться любые живые организмы – клетки бактерий, грибов, растений, животных и человека. В зависимости от этого различаются и методы введения рек-вектора в клетки реципиентов. Наиболее часто применяется метод трансформации (в различных модификациях, но могут использоваться и другие рекомбинативные методы, такие как коньюгация, трансдукция, трансфекция. Кроме того, применяются метод электропорации и метод “пушки”.

Метод трансформации. Трансформация – перенесение в реципиентную клетку изолированных фрагментов ДНК, что может приводить к появлению у клеток-трансформантов признаков, присущих организму, из которого получена эта ДНК. Организм, из которого получают ДНК для трансформации, называют донором, а организм, в который вводят ДНК, - реципиентом. Применение метода трансформации в генной инженерии основанона способности “голой” ДНК проникать в клетки практически любых организмов. Ограничением применения этого метода при использовании в качестве реципиентов микробных и растительных клеток является их плотная клеточная стенка. Для ее частичного или полного разрушения используют ферменты, однако ферментативный гидролиз необходимо проводить в мягких условиях (например, в изотоническом или гипертоническом растворе), чтобы не повредить мембраны клеток и сохранить их целостность. Для разрушения клеточных стенок бактерий используют такие ферменты, как лизоцим, лизоамидаза, субтилизин и др. Ферментативный гидролиз клеточных стенок дрожжей можно осуществить с помощью комплекса глюканаз, маннаназ и хитиназ. Для гидролиза оболочек растительных клеток используют целлюлолитические ферменты. Трансформацию животных клеток проводят без обработки ферментами, так как они лишены плотных оболочек.

Эффективность трансформации зависит от многих факторов: количества вносимой ДНК, способа ее выделения и очистки, величины фрагментов, а также от физиологического состояния клетки-реципиента. При переносе ДНК в цельные клетки частота трансформации составляет в среднем 10^-5 - 10^-8, при использовании протопластов (клеток, лишенных клеточных стенок) частота трансформации может быть значительно выше – до 10^-3 - 10^-4. Клетки, способные поглощать ДНК, называют компетентными. У бактерий компетентность – это особое состояние, при котором на поверхности оболочки появляются специфические белки и ферменты, обеспечивающие адсорбцию, частичную деградацию ДНК на фрагменты, разделение комплементарных цепей и проведение одноцепочечных фрагментов ДНК внутрь клетки. Компетентность в бактериальной культуре наблюдается обычно в экспоненциальной или стационарной фазах роста. Долю компетентных клеток можно повысить, испльзуя специальные среды и условия культивирования. Так, у кишечной палочки частота трансформации существенно повышается под воздействием теплового шока, катионов Rb⁺, хлорида гексамин- кобальта, при выращивании на среде с повышенным содержанием ионов магния (10-20 мМ).

Одним из самых простых методов трансформации является кальциевый метод, при котором клетки реципиента обрабатывают ледяным раствором хлорида кальция и выдерживают суспензию при 42⁰С в течение 1,5 мин. Благодаря локальному разрушению клеточных стенок бактерий частота трансформации увеличивается до 10^-3.

Иногда для трансформации клеток бактерий, животных и растений используют полиэтиленгликоль, который также повышает компетентность реципиентных клеток.

В некоторых системах “донор-реципиент” оказывается невозможным провести эффективную трансформацию. В этом случае для доставки плазмид-векторов в клетки реципиента используют метод коньюгации. Так, если ввести рек-вектор в промежуточную клетку, несущую F-фактор (плазмида, несущая гены для обеспечения коньюгативного переноса), то векторная плазмида может интегрироваться в F-фактор и вместе с ним по F-пилям переноситься в клетку-реципиент.

Иногда гены для встраивания клонируют в фагах и других вирусах. В этом случае для переноса вирусных векторов в клетки реципиентов используют метод трансдукции, а именно, заражают клетки реципиента вирусной рек-ДНК и именно она осуществляет доставку чужеродных генов в геном, что придает реципиенту новые свойства. В том случае, если клетки бактерий поглощают ДНК бактериофагов и в результате происходит созревание фаговых частиц, говорят о трансфекции фаговой ДНК.

Метод электропорации основан на применении импульсного электрического тока высокой напряженности. Клетки вместе с векторной ДНК помещают в небольшую ячейку между двумя электродами и подвергают кратковременному (10-100 мкс) воздействию электрического поля. Это приводит к образованию временных пор в клеточных оболочках реципиентов, повышает их проницаемость и проводимость для макромолекул. Специально созданные для этих целей лазерные инжекторы способны за одну секунду формировать в облучаемой клетке до 600 пор. Это позволяет существенно увеличить частоту трансформации и особенно для крупных плазмид-векторов.

Метод молекулярной пушки чаще применяется в случаях, когда клетки реципиента являются трудно проницаемыми для трансформируемой ДНК. С помощью специального устройства реципиентные клетки «обстреливают» микроскопическими ядрами из золота, кадмия или других металлов, на которые нанесена векторная рек-ДНК, что обеспечивает проникновение чужеродной ДНК в клетку и геном.