ПРИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПИЩЕВЫХ ОТРАВЛЕНИЯХ 8 страница

Хорошо смешивают и разливают асептично в (стерильные пробирки по 10 мл.

Приготовление раствора сернистокислого висмута.

Растворяют 1-20 г сернистокислого натрия (Nа₂SO₃) в 100 мл кипящей воды, 2-0,1 г аммоний-висмут лимоннокислого в 100 мл ки­пящей воды и 3-20 г маннита в 100 мя (кипящей воды. Смешивают растворы 1 и 2, кипятят, смесь в течение 1 минуты и добавляют раст­вор 3. Готовая смесь имеет белый цвет, мутная; перед использованием перемешать. Раствор можно хранить месяц в холодильнике.

Кровяной - солевой агар (среда Wagatsuma).

Состав:

Дрожжевой экстракт Пептон Натрий хлористый (Nad) Манвит Агар 0,1% кристалл-виолет

5 г 10 г 70 г 5 г 15 г 0,01 мл

Растворяют все ингредиенты в 1 литре дистиллированной воды и доводят рН до 7,5. Нагревают кипячением в течение нескольких минут до полного растворения всех ингредиентов. Не стерилизуют. Охлаждают до 50^е и добавляют 10% отмытых чемовечееких эритроцитов. Все смешивают и разливают в чашки Петри.

Среда Никодемуса

Состав:

Любой стерильный 2% питательный агар 1000 мл

Этиловый спирт 80 мл

Эмульсия двух желтков

К расплавленному и охлажденному до 45-60⁰С агару добавляют этиловый спирт и после перемешивания эмульсию яичных желтков. Тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри, которые можно хранить в холодильнике не более 3 суток. Эмульсию яичных желтков готовят путем эмульгирования отделенных от белка 2 желтков в 10 мл стерильного физиологического раствора.

Среда Донована

Состав:

Любой стерильный питательный агар 11000 мл

Трехзамещенный цитрат натрия 2,5 г

Хлористый литий (LiCe.H₂O) 2,5 г

Стерилизуют при 110⁰С 30 минут, охлаждают до 45-50⁰С и добавляют полимиксин «М» 200 000 ед. и эмульсию двух желтков.

Тщательно (перемешивают и разливают в чашки Петри, которые можно хранить в холодильнике не более 7-10 дней.

Солевой-полимиксиновый агар с 2, 3, 5-трифенил-тетразолий хлоридом (ТТХ)

Состав:

Любой стерильный 2% питательный агар 11000 мл

Хлористый натрий (NaCl) 60 г

Полимиксин «М» 200 000-400 000 ед.

2, 3, 5 - трифенилтетразолий хлорид 0,1—0,2 г

Эмульсия двух желтков

В агар после расплавления и охлаждения до 46-50⁰С добавляют полимиксин, 2, 3, 5-ТТХ и эмульсию желтков, хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри, которые можно хранить в холодильнике не более 7-10 дней.

 

Желточно-солевой агар (ЖСА)

В качестве основы используют селективный солевой агар для стафилококков. По прописи, указанной на этикетке, готовят агар. К расплавленному и охлажденному до 45-50⁰С агару добавляют 20 % желточной взвеси (асептически извлеченный из яйца желток взбалтывают с 200 мл изотонического раствора хлорида натрия). Смешивают агар с желточной взвесью, разливают по 20 мл в чашки Петри. Хранят в холодильнике в течение 2-х недель.

Молочно-солевой агар.

К расплавленному и охлажденному до 45-50⁰С солевому агару добавляют 10 % стерильного обезжиренного молока, смешивают и разливают среду в чашки Петри. Хранят в холодильнике не более 2-3-х дней.

Солевой бульон.

6,0 г хлористого натрия растворяют в 100 см³ мясо-пептонного бульона, устанавливают р Н так, чтобы после стерилизации он составлял при 25⁰С 6,9 + 1. Бульон разливают в колбы или пробирки и стерилизуют при (121 + 1) ⁰С в течение 15 мин.

Сахарный бульон.

1,0 г глюкозы растворяют в 100 см³ мясо-пептонного бульона, устанавливают р Н так, чтобы после стерилизации он составлял при 25⁰С 6,9 + 1. Бульон разливают в колбы или пробирки и стерилизуют при (121 + 1) ⁰С в течение 15 мин.

Среда с ДНК.

6,1 г трисаминометана растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, доводят рН раствора до (9,0 + 0,1). К раствору добавляют 0,3 г ДНК, 10 г хлористого натрия, 1,1 см³ раствора хлористого кальция концентрации 1 г/дм³, 15 г агара, нагревают до полного расплавления агара. К охлажденной до 55-65⁰С среде добавляют 9,2 см³ раствора толуидина синего (1,0 г толуидина синего «С» растворяют в 100 см³ дистиллированной воды) перемешивают и разливают по чашкам Петри. Хранить среду при температуре (6,0 + 2,0) ⁰С не более 7 суток

Кристалл-виолет-азид-кровяной агар (среда Пейкера)

Состав:

а) основной агар:

мясо-пептонный бульон 1000 мл.

хлористый натрий (NaCl) 5 г.

агар-агар 15 г

б) 0,05% водный раствор кристалл-виолета

в) 5,0% водный раствор азида натрия (NaN₃)

г) цитратная или дефибрвнврованная кровь кролика или человека.

Части «а» и «б» стерилизуют при 12⁰С в течение 20 минут, часть «в» стерилизуют текучим паром 30 минут.

Для приготовления среды берут стерильно:

основного агара расплавленного и охлажденного до 45⁰С 100 мл.

0,05% водного раствора кристал-виолета 0,4 мл.

5,0% водного раствора азида натрия 1 мл.

цитратиой или дефибрннироваиной крови 5 мл.

Все тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Чашки со средой можно хранить в холодильнике не более 7 дней.

Молочная среда с полимиксином (среда Калины)

Состав:

Расплавленный и охлажденный до 46⁰С основной агар (как в среде Пейкера) 85 мл

01% водный раствор кристаллвиолета 125мл

10% водный раствор 2, 3, 5-ТТХ 0,5 мл

Стерильное обезжиренное молоко 15 мл

Полимиксин «М» 20000-40000

Все ингредиенты смешивают асептично и среду тонким слоем разливают в чашки Петри. Чашки со средой можно хранить в холодильнике 7-10 дней.

Энтерококковая дифференциально-диагностическая среда (ЭДДС)

Состав:

Сухой питательный агар 35 г

Автолизат дрожжевой 20 мл

Глюкоза 10 г

Дистиллированная вода 800 мл

Расплавляют при нагревании, профильтровывают, стерилизуют при 112⁰С 15 мин, рН 7,2-7,4. Перед разливкой в чашки, в питательную среду добавляют ТТХ 0,1 г водного раствора кристаллического фиолетового 0,01 % 12,5 мл, налидиксовой кислоты 0,1 г, стерильного обезжиренного молока подогретого до 45⁰С 200 мл, свежей дефибринированной крови (животного или человека) 50 мл. Содержимое размешивают и разливают по чашкам по 7 мл.

Сахарно-дрожжевой питательный агар

Состав:

Сухой питательный агар 35 г

Дрожжевой автолизат 20 мл

Глюкоза 10 г

Дистиллированная вода 1000 мл

Расплавляют при нагревании, стерилизуют среду при 112⁰С 15 мин, рН 7,2-7,4.

Сахарно-дрожжевой питательный агар с теллуритом калия.

Состав:

Сухой питательный агар 35 г

Дрожжевой автолизат 20 мл

Глюкоза 10 г

Дистиллированная вода 1000 мл

Приготовленную смесь расплавляют при нагревании, добавляют лимоннокислого натрия 5,0 г.

Стерилизуют среду при 112⁰С 15 мин, рН 7,2-7,4. Перед разливкой среды в стерильные чашки добавляют 50 мл лошадиной сыворотки, 0,1 г налидиксовой кислоты и 0,7 г (35 мл 2 % водного раствора) теллурита калия, тщательно размешивают.

Желчно-щелочной агар.

Компоненты, рассчитанные на 1000 мл сахарно-дрожжевого питательного агара, растворяют в 600 мл дистиллированной воды, вносят 400 мл медицинской желчи. Перед разливкой в чашки добавляют 50 мл крови человека, или животного, 12,5 мл 0,01 % раствора кристаллического фиолетового и 20 мл 10% раствора КОН.

Питательный бульон с глюкозой

К100 мл питательного бульона, рН 7,2-7,4 прибавляют 0,2 г глюкозы. Среду стерилизуют однократно 15 мин при 0,5 атм.

Среда с 2, 3, 5 — трифенилтетразолий хлоридом (ТТХ).

Состав:

мясопептонный бульон 100 мл

дрожжевой экстракт 2 мл

хлористый натрий (NaCe) 0,5 г

агар-агар 1,5 г

глюкоза 1 г

2, 3, 5-ТТХ 0,01 г

Все ингредиенты, кроме ТТХ, автоклавируют при 121⁰С 10-12 мин. 2, 3, 5- ТТХ растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды стерилизуют текучим паром в течение 30 мин.

Среда с молоком

Состав:

мясопептонный бульон 80 мл

молоко (стерильное) 20 мл

глюкоза 0,2 г

агар-агар 1,5 г

Стерилизуют при 121⁰С в течение 10-12 мин. Среда в чашках Петри нится в холодильнике не более 7-10 дни. Стерильное молоко добавляют в среду перед разливкой в чашки Петри.

Среда Китт-Тароцци.

Стерильные пробирки заполняют на 1-1,5 см кусочками печени, мяса или рыбы и заливают приготовленным мясо-пептонным бульоном с глюкозой и агаром. В 1 дм³ мясо-пептонного, рыбо-пептонного или печеночного бульона вносят 10 г глюкозы и 1,5 г агара, при нагревании постепенно расплавляют и стерилизуют при (121 + 1) ⁰С, рН проверяют до и после стерилизации (7,1 + 0,1). При приготовления среды впрок вместо добвления к ней агара на поверхность среды перед стерилизацией в пробирки наслаивают 0,5-1 см вазелинового масла. При применении среды Китт-Тароцци без добавления в нее агара или вазелинового масла на поверхность среды после посева наслаивают голодный агар или парафиновую смесь высотой 1-1,5 см. При посевах свежеприготовленную среду Китт-Тароцци (не более 3-х суток с момента приготовления) добавлять агар, вазелиновое масло или наслаивать на ее поверхность голодный агар не обязательно.

Печеночно-глицериновая среда.

К 1 дм³ печеночного бульона добавляют 5 г глицерина, 5 г глюкозы, разливают в пробирки или флаконы с кусочками печени (20-30 г печени на 100см³), устанавливают рН (7,0 + 0,1) и стерилизуют при (121 + 1)⁰С - 20 мин.

Бульон триптиказо-пептонно-глюкозный с дрожжевым экстрактом и трипсином.

50 г триптического перевара казеина, 5,0 г пептона, 100 см³ дрожжевого экстракта, 4,0 г глюкозы, 1,0 г тиогликолята натрия добавляют к 900 см³ дистиллированной воды, устанавливают рН (7,0 + 0,1) и стерилизуют при (121 + 1)⁰С пробирки - 10 мин, флаконы – 15 мин. Хранят при комнатной температуре не более 7 суток. Применяют для культивирования C. Botulinum, образующих прототоксин, перед употреблением к 1000 см³ бульона добавляют 60 см³ 1,5 %-ного раствора трипсина в фосфатно-буферном растворе.

Среда Вильсон-Блер, измененная для анаэробов.

Раствор железоаммонийных квасцов концентрации 50 г /дм³ и раствор сернисто-кислого натрия с массовой концентрацией 200 г/дм³ готовя на стерильной дистиллированной воде, extempore. Раствор сернисто-кислого натрия стерилизуют текучим паром в течение 1 часа. К 100 см³ расплавленного и охлажденного до 80⁰С мясо-пептонного агара концентрации глюкозы 10 г/дм³ добавляют 10 см³ раствора сернисто-кислого натрия и 1 см³ раствора железоаммонийных квасцов. Устанавливают рН 7,5-7,8.

Лакмусовое молоко.

К стерильному молоку добавляют лакмусовую настойку до получения сиреневого окрашивания (на 100 см³ молока – 1 см³ лакмусовой настойки). Лакмусовое молоко разливают по стерильным пробиркам высоким столбиком, кипятят на водяной бане 15-20 мин и охлаждают для посева до 45⁰С.

Питательные среды для выделения и идентификации кампилобактерий.

Транспортная среда Кери-Блэр.

Растворить в 991мл дистиллированной воды при нагревании на водяной бане следующие ингридиенты: натрия тиогликолят – 1,5г, натрия фосфат двузамещенный – 1,1г, натрия хлорид -5г, агар-агар – 1,6г. При исследовании материала методом мембранных или ядерных фильтров количество агар-агара необходимо уменьшить до 0,4-0,5г. В охлажденную до 40-45⁰С основу добавить 9мл свежеприготовленного 1% раствора кальция хлорида. Установить рН 8,4. Разлить по 10-12 мл в стерильные центрифужные пробирки, стерилизовать 120⁰С 30мин.

Транспортная среда Амиеса.

Состав:

Уголь активированный	10г
натрия хлорид	3г
Na2HPO4	1,15г
KH2PO4	0,2г
KCl	0,2г
CaCl2	0,1г
MgCl2	0,1г
натрия тиогликолят	1г
агар-агар	4г
вода дистиллированная	1л

Разлить по пробиркам и стерилизовать 121⁰С 15мин.

Среда Preston для выделения кампилобактерий из молока.

Состав:

Питательный бульон с 5% лизированных эритроцитов лошади

Полиммиксин В 5МЕ/мл

Рифампицин 10мг/л

Триметоприм 10мг/л

Циклогексимид 0,1г/л

Среда Парка для исследования продуктов птицеводства.

Состав:

Бульон для бруцелл с 7% лизированной лошадиной крови

FBP – добавка

Ванкомицин 20мг/л

Триметоприм 10мг/л

Полимиксин В 500МЕ/л

Добавка для повышения аэротолерантности (FBP – добавка)

Состав:

Железа сульфат II 0,25г

Натрия метабисульфит 0,25г

Натрия пируват 0,25г

Навески солей внести в сухую стерильную пробирку, добавить 5 мл стерильной дистиллированной воды. Указанное количество добавок рассчитано на 1л питательной среды. Растворение солей занимает 15-20мин при периодическом встряхивании пробирки. Правильно приготовленный раствор имеет оливковый цвет. Раствор не подлежит хранению и должен быть использован в день приготовления.

Кровяной эритрит-агар.

40г эритрит-агара размешать в 1л дистиллированной воды, довести до кипения и кипятить до полного растворения 2-3мин. Среду разлить по 400мл, стерилизовать 121⁰С 20мин. В остуженную до 50-55⁰С питательную основу внести FBP – добавку и 20 мл бараньей, лошадиной или донорской крови. Для придания селективных свойств возмлжно использовать одну из приведенных ниже селективных смесей.

Кровяные добавки.

Баранью или лошадиную кровь, асептически взятую у здоровых животных, дефибринировать с помощью стеклянных бус и хранить до использования при 4⁰С в течение 7-10 дней.

Смесь антибиотиков 1. Смесь антибиотиков 2.

Ванкомицин 2,0 мг Цефоперазон 32,0 мг

Полимиксин 0,05 мг Ванкомицин 10,0 мг

Триметоприм 1,0мг на 200 мл среды Амфотерицин В 3,0 мг на 1000мл среды

 

Необходимые количества антибиотиков взвесить на весах и внести во флакон с 3,0 мл дистиллированной воды; смесь растворить при тщательном перемешивании.

Угольный эритрит-агар.

Состав:

Эритрит-агар 36г

Железо II сернокислое 0,15г

Экстрат кормовых дрожжей (ЭКД) 4г

Уголь бактериологический активированный 4г

Вода дистиллированная 4г

Стерилизовать автоклавированием 121⁰С 15мин.

Агар Эндо, агар с эозин-метиленовым синим (ЭМС-агар), агар Плоскирева, висмут-сульфит агар, трехсахарный агар с солями железа, (TSI), среда Кесслера, энтерококкагар, азидный агар с эскулином и желчью, энтерококкагар, среда Клиглера, среда Олькеницкого, SS-агар (сальмонелла-шигелла агар), XLD агар (ксилозо-лизин-дезоксихолатный), ТСВS-агар (тиосульфат-цитрат-желчно-сахарозный агар), среда для контроля стерильности (тиогликолиевая среда), селенитовый бульон, питательная среда для накопления сальмонелл – магниевая среда, среда Левина, основа агара Байэрд-Паркера, транспортная среда Амиеса с активированным углем, основа тетратионатного бульона, эритритагар – сухие промышленные питательные среды, состав и способ приготовления указаны на этикетке.

Допускается использование других коммерческих питательных сред, систем идентификации и диагностических препаратов, предназначенных для целей описываемых методов зарегистрированных в Республике Беларусь в установленном порядке. При их применении руководствоваться рекомендациями фирмы-производителя.

 

Приложение 1

Биохимические свойства бактерий рода Salmonella

Тесты или субстраты	Реакция	Тесты или субстраты	Реакция
Адонит Арабиноза Глицерин (по Штерну) Глюкоза (газ) Дульцит Инозит Ксилоза Лактоза Мальтоза Маннит Рамноза Салицин Сахароза Сорбит Трегалоза Реакция с метиловым красным Реакция Фогес-Проскауэра Индол	- +, (+) х +, - х х х х + + + - - + +   +   - -	Сероводород Мочевина (гидролиз) Желатин (22 0С) Фенилаланиндезаминаза Лизиндекарбоксилаза Аргининдекарбоксилаза Орнитиндекарбоксилаза Глутаминовая кислота Цитрат Симонса Цитрат Кристенсена Восстановление нитратов Ацетат Малонат Мукат D-Тартрат I-Тартрат L-Тартрат β-Галактозидаза KCN Подвижность	+, - - х - +, - +, (+) + - +, - х + х х х +, (-) х х + х +, -

- отрицательная реакция в течение всего срока наблюдения у 90% штаммов или более; + положительная реакция через 18-24 ч у 90% штаммов или более; +, (+) чаще положительная, реже замедленно положительная у 90% штаммов или более; х – различные результаты реакции; +, - чаще положительная, реже отрицательная реакция у 90% штаммов и более; +, (-) чаще положительная, реже замедленно отрицательная реакция у 90% штаммов и более.

Приложение 2

Дифференциальные характеристики видов и подвидов сальмонелл

Род	Salmonella
Вид	S. enterica	S. bongori
Подвид	enterica I	salamae II	arizonae IIIa	diarizonae IIIb	houtenae IV	indica VI	V
Свойства
Дульцит	+	+	-	-	-	d	+
ONPG (2 ч)	-	-	+	+	-	d	+
Малонат	-	+	+	+	-	-	-
Желатиназа	-	+	+	+	+	+	-
Сорбит	+	+	+	+	+	-	+
Рост с KCN	-	-	-	-	+	-	+
L(+) тартрат*	+	-	-	-	-	-	-
Галактуронат	-	+	-	+	+	+	+
γ-глютамил-трансфераза	+ **	+	-	+	+	+	+
β - глюкуро-нидаза	d	d	-	+	-	d	-
Мукат	+	+	+	-(70%)	-	+	+
Салицин	-	-	-	-	+	-	-
Лактоза	-	-	+(75%)	+(75%)	-	d	-
Лизис:фаг 01	+	+	-	+	-	+	d
Обычная среда обитания	Теплокровные животные	Холоднокровные животные и окружающая среда
* или D-тартрат; ** Thyphimurium, Dublin -; d= различные результаты, получаемые от различных штаммов; + = 90% или более положительных реакций; - = 90% или более отрицательных реакций

 

Приложение 5

Основные дифференциальные признаки сальмонелл и сходных

энтеробактерий

Тесты или субстраты	Роды
Salmonella	Citrobacter	Proteus	Klebsiella	Hafnia	Serratia	Enterobacter
β- Галактозидаза	+	+	-	+	+	+	+
Индол	-	Х	Х	Х	-	-	-
Сероводород	+,-	+,-	+,-	-	-	-	-
Гидролиз мочевины	-	+,(-)	Х	(+)	-	Х	Х
Рост в присутствии КСN	Х	+	+	+	+	-	+
Лизиндекарбоксилаза	+	-	-	Х	+	+	+
Цитрат	+	+			+	+	+
Малонат	Х	Х	-	+	Х	-	+,-
Мукат	Х	+		Х	-	-	Х
D-Тартрат	Х	+		Х	-		-
Реакция Фогеса-Проскауэра	-	-	-	Х	Х	Х	+
Гидролиз желатина	Х	-	Х	Х	-	+	-,(+)
Фенилаланин	-	-	+	-	-	-	-

 

- отрицательная реакция в течение всего срока наблюдения у 90% штаммов или более; + положительная реакция через 18-24 ч у 90% штаммов или более; +, (+) чаще положительная, реже замедленно положительная у 90% штаммов или более; х – различные результаты реакции; +, - чаще положительная, реже отрицательная реакция у 90% штаммов и более; +, (-) чаще положительная, реже замедленно отрицательная реакция у 90% штаммов и более.

Приложение 6

Биохимические свойства сальмонелл

 

Тест	Положительный или отрицательный результат	% штаммов сальмонелл дающих результат
Глюкоза (кислотообразование) Глюкоза (газообразование) Лактоза Сахароза H2S Расщепление мочевины Лизиндекарбоксилаза β – галактозидаза Фогес-Проскауэр Индолообразование	+   +   - - + - + - - -	91,9   99,2 99,5 91,6 99,0 94,6 98,4 98,9