ПРИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПИЩЕВЫХ ОТРАВЛЕНИЯХ 3 страница

Критерии диагностики. Возникновение пищевого отравления, вызванного эшерихиями, обычно связано с массивной контаминацией продуктов. В связи с этим значение имеет количественное определение степени обсемененности продуктов этими бактериями.

В случае выделения штаммов эшерихий, подозрительных как возбудителей заболевания, необходимо установить идентичность культур выделенных из разных материалов (пищевые продукты, смывы, рвотные массы, промывные воды и др.) по морфологическим, ферментативным, культуральным свойствам и расшифровать их антигенную структуру. В целях установления эпидемических связей используется определение сероваров.

Бактериологическое исследование клинического материала.

Первый день. Испражнения засевают на среду (Эндо, ЭМС) таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний (готовят ряд разведений в изотоническом растворе хлорида натрия). Жидкие материалы засевают без разведения. Инкубируют в течение 18-20 ч. при 37⁰С.

Второй день. Изучают колонии выросшие на средах Эндо, ЭМС. При наличии только однотипных колоний для дальнейшего исследования намечают 10 колоний. При обнаружении 2-3 и более видов колоний намечают 3-5 колоний каждого вида. Поиск и первичный отбор колоний выросших на чашках первичного посева, проводят серологическим методом в реакции агглютинации на стекле с использованием поливалентной сыворотки ОКА. Оставшуюся часть колоний, давшей положительную реакцию с сывороткой ОКА, отсевают на скошенный агар и на одну из комбинированных сред для первичной идентификации.

Третий день. Культуры «подозрительные» на принадлежность к роду Escherichia (по данным комбинированной среды) повторно проверяют в реакции агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой ОКА и при положительном результате испытывают с поливалентными сыворотками (ОКБ, ОКС, ОКД, ОКЕ) или ОК – иммуноглобулинами. При наличии положительной реакции культуры засевают со скошенного агара в питательные среды для воспроизведения тестов минимального дифференцирующего ряда, необходимых для подтверждения принадлежности культуры к роду Escherichia согласно приложению 4 к настоящей Инструкции.

Четвертый день. При подтверждении принадлежности бактерий к эшерихиям проводят испытание в агглютинационном тесте на стекле с моновалентными ОК – сыворотками или иммуноглобулинами, входящими в поливалентную сыворотку, давшую положительную реакцию (живая культура), и определяют в агглютинационном тесте на стекле О-антиген с адсорбированными групповыми и факторными О-сыворотки (культура, прогретая 30 мин при 100⁰С), если таковые имеются. При наличии положительного результата реакции агглютинации с живыми и подогретыми культурами обозначают ОК группу изучаемого штамма в соответствии с использованными диагностическими препаратами. При отсутствии ОК – иммуноглобулинов и адсорбированных О – сывороток подтверждают принадлежность культур к соответствующей ОК – группе в пробирочном агглютинационном тесте с возрастающими разведениями ОК-сыворотки до ее О-титра, указанного на этикетке, в двух рядах пробирок (живая и подогретая 1 ч при 100⁰С). Учет результатов осуществляют через 18-20 ч инкубируют при 37⁰С.

Пересев культуры с установленной или ориентировочно определенной ОК – группой на глицериновый агар, скошенный в пробирке для типирования бактерий по Н – антигену в аглютинационном тесте на стекле (при наличии соответствующих диагностических прапаратов). Инкубация 18-20 ч при 37⁰С.

Пятый день. Обозначение ОК-группы эшерихий при наличии положительного результата в соответствующей сыворотке: агглютинация до титра или половины титра К-антител (с живыми бактериями) и О- антител (с прогретыми бактериями). Серологическое типирование по Н- антигену культуры (с глицеринового агара) в агглютинационном тесте на стекле вначале в поливалентных, затем в моновалентных Н – сыворотках (входящих в соответствующую поливалентную, с которой реагировала культура). По совокупности определенных разновидостей О-, К- и Н- антигенов устанавливают серовар штамма эшерихий.

При определении Н- антигена методом иммобилизации из пробирки с положительным результатом в поливалентной Н- сыворотке (рост бактерий только по ходу укола) производят посев культуры в пробирки, содержащие полужидкий агар и моновалентные Н- сыворотки, соответствующие поливалентной, давшей положительный результат иммобилизации. Инкубируют 18-20 ч при 37⁰С.

Шестой день. Учет иммобилизации культуры и при положительном результате обозначение соответствующего Н-антигена. По совокупности установленных разновидностей О-, К-, Н- антигенов определение серовара штамма эшерихий.

Исследование пищевых продуктов.

Для получения количественных показателей обсемененности продукта, из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений так, чтобы можно было определить в 1 г (см³) продукта количество E. сoli. По 0,1 или 0,2 см³ навески продукт или его разведения наносят на поверхность двух параллельных чашек Петри со средой Эндо.

Для выявления E. сoli в определенной навеске продукта навеску или его эквивалентное разведение вносят в среду Кесслера. Соотношение между количеством высеваемого прдукта, или его разведением и питательной средой 1:9, а для сред двойной концентрации 1:1. Посевы на агаризованных и жидких средах инкубируют при 37⁰С в течение 24-48 ч. Посевы просматривают через 24 ч, отмечают положительные посевы в жидкие среды, окончательный учет проводят через 48 ч. Положительными считаются посевы в жидкие среды, в которых имеет место интенсивный рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды, образовании газа, подкисления среды (изменении цвета среды). Для подтверждения принадлежности микроорганизмов выросших на жидких средах к E. сoli производят пересевы на поверхность среды Эндо. Инкубируют при 37⁰С 24-48 ч. Посевы на агаризованных средах просматривают, отмечают рост характерных колоний, принадлежность выросших колоний к E. сoli проводят как описано выше при исследовании клинического материала, отбирают не менее чем 5 колоний, если при подтверждении характерных колоний в 80 % случаев, т.е. не менее чем в 4 из 5 колоний, подтвержден рост E. сoli, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашке Петри принадлежат к E. сoli. В остальных случаях количество E. сoli определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения. Пересчитывают их количество на 1г (см³) исследуемого материала, общепринятым способом.

 

ГЛАВА 6

БАКТЕРИИ РОДА PROTEUS

В этиологии пищевых отравлений ведущую роль играют бактерии рода Proteus. Протеи широко распространены в природе и встречаются в почве, сточных водах, навозе. В кишечнике человека и животных присутствие этих микробов менее постоянно. Протей содержится в испражнениях только у 5-10% здоровых людей. Заболевания могут возникнуть при употреблении продуктов, обильно контаминированных этим возбудителем. Это могут быть мясные изделия, особенно из рубленого мяса, рыбные блюда, овощные салаты и др. Отличить Proteus, Providencia и Morganella от других представителей Enterobacteriaсeae можно по признаку наличия фенилаланиндезаминазы. Признаки позволяющие отличить Proteus, Providencia и Morganella согласно приложению 21 к настоящей Инструкции.

Бактерии рода Proteus относятся к семейству Enterobacteriaсeae. Род состоит из 4 видов: P.mirabilis, P.myofaciens, P.penneri, P.vulgaris. Чаще вызывают заболевания у человека - P.mirabilis, P.vulgaris.

Род образуют прямые палочки с закругленными концами размером 0,4-0,8х1-3 мкм, грамотрицательные, бескапсульные, подвижные (перитрихи, подвижность более выражена при 20-22⁰С).Многие роятся, образуя ползучие колонии с отростками. Оксидазоотрицательные, каталазоположительные, реакция с метиловым красным положительная. По образованию индола, реакции Фогес-Проскауэра и пробе на среде Симмонса с цитратом виды различаются. Лизиндекарбоксилаза и аргининдигидролаза отсутствуют. Декарбоксилировать орнитин способен только Р.mirabilis. Осуществляют окислительное дэзаминирования фенилаланина и триптофана, гидролизуют мочевину. Разлагают тирозин, растут в прсутствии KCN, обычно образуют H₂S, малонат не используют. Биохимические свойства представлены в приложении 21 к настоящей Инструкции.

В практических лабораториях для определения принадлежности выделенных бактерий к роду Proteus достаточно использовать ограниченное число тестов.

Протеи растут на простых питательных средах, температурный оптимум 35-37⁰С, оптимум рН 7,2-7,4. Рост бактерий сопровождается появлением гнилостного запаха. На твердых средах жгутиковые (Н-) формы характеризуются сплошным ростом. При посеве бляшкой бактерии дают феномен «роения». На среде Плоскирева формируют крупные (d 2-3 мм) полупразрачные изолированные колонии правильных очертаний, слегка выпуклые с желтовато-розовым оттенком (в зоне роста среда подщелачивается и желтеет). На висмут-сульфит агаре через 48 ч образуют серо-коричневые колонии (с черно-коричневой зоной под ними), на агаре Эндо формируют бесцветные колонии. Вызывают помутнение жидких питательных сред.

Антигенная структура. У протеев обнаружены О-, Н-, К-, антигены. Диагностическое значение имеют: соматический О-антиген и жгутиковый Н-антиген. О-антиген расположен в бактериальной клеточной стенке и представляет собой полисахаридно-липидно-белковый комплекс. Серологическую специфичность О-антигена определяет его полисахарид. О-антиген обладает термостабильностью. Термолабильный Н-антиген является белковым соединением и содержится в жгутиках.

Серовар бактерий рода Proteus устанавливается по сочетанию О- и Н-антигенов с учетом их факторного состава.

Критерии диагностики. Доказательством этиологической роли протея является массивное обнаружение этого микроба в пищевых продуктах, в испражнениях (10⁶ и более в 1г.) при наличии клинических симптомов заболевания, в рвотных массах.

Бактериологические исследования.

Первый день. Для количественного учета и получения чистой культуры первичный посев исследуемого материала производят по 0,1 мл из десятикратных разведений в 0,1% стерильной пептонной воде, до разведения 10^-6 в конденсационную воду свежескошенного мясо-пептонного агара по методу Шукевича и на поверхность питательных сред (Плоскирева, висмут – сульфит агар)

Посевы помещают в термостат при температуре 37⁰С на 18-24 часа.

Второй день. Просматривают посевы на скошенном мясо-пептонном агаре. Если регистрируют ползучий нежный вуалеобразный рост, то определяют титр по наименьшему количеству засеянного материала, в котором обнаружен рост бактерий рода Proteus.

После инкубации в течение 18-24 часов в термостате при 37⁰С чашки с посевами просматривают и отмечают характерные колонии, подлежащие дальнейшему исследованию. Наличие на среде Эндо или ЭМС, при выявлении других представителей семейства Enterobacteriaсeae, ползучего роста дает основание определить в исследуемом материале бактерии рода Proteus. Для биохимического и серологического типирования необходимо изучение отдельных изолированных колоний. Для получения изолированных колоний со среды Эндо или ЭМС делается пересев в пробирки с бульоном и после 4-5 часовой инкубации при 37⁰С повторный пересев на слабщелочной агар с 0,4% карболовой кислотой, или среду Плоскирева, SS-агар, висмут-сульфит агар. На следующий день изолированные колонии подвергаются дальнейшему изучению по обычной схеме.

Если рост 18-24-часовой культуры однородный, то для дальнейшего изучения используют не менее трех колоний, при росте разных колоний для их изучения надо брать больше колоний, различных по внешнему виду.

Для определения родовой принадлежности изучаемого штамма изолированные колонии отсевают в пробирку с мясопептонным бульоном, из которого после 4-5-часовой инкубации при 37⁰С производят пересевы на следующие среды: бульон или пептонную воду для определения индола, среду с мочевиной для определения фермента уреазы, агар Клиглера для определения ферментации глюкозы и образования сероводорода, 6 или 10% лактозу, 0,5% мальтозу, 0,3% полужидкий агар для определения подвижности; скошенный слабощелочной агар для серологического типирования.

Третий и четвертый дни. Учитывают результаты ферментативной активности культур, выделенных накануне. Грамотрицательные культуры, ферментирующие глюкозу, гидролизующие мочевину, образующие сероводород и не ферментирующие лактозу, оценивают как бактерии, принадлежащие к роду Proteus. На основании способности к индолообразованию и ферментации мальтозы определяют принадлежность к одному из видов: штаммы, ферментирующие мальтозу и образующие индол, относят к Proteus vulgaris; штаммы, не ферментирующие мальтозу и не образующие индол, к Proteus mirabilis. При необходимости более углубленного изучения ферментативных свойств выделенную культуру изучают по всем тестам, согласно приложению 21 к настоящей Инструкции.

Если изучаемый штамм продуцирует индол и сероводород, не ферментирует (или ферментирует) лактозу и не расщепляет мочевину, необходимо произвести дифференциацию между редко встречающимися видами рода Proteus, не гидролизующими мочевину или ферментирующими лактозу, и индолположительными вариантами Salmonella и Citrobacter.

Такие штаммы следует в первую очередь проверить на наличие фенилаланиндезаминазы. Для определения фенилаланиндезаминазы производят посев в пробирки со скошенным агаром, содержащим фенилаланин. Через 18-24 часа инкубации при 37⁰С на поверхность среды с ростом наслаивают 10% хлорное железо (FeCl)₃). Появление интенсивной зеленой окраски свидетельствует о положительной реакции. Штаммы, дезаминирующие фенилаланин, относятся к роду Proteus. Штаммы, не образующие фенилаланиндезаминазу, подвергают дальнейшему изучению для определения их принадлежности к другим родам семейства Enterobacteriaceae.

Серологическое типирование. Штаммы, отнесенные на основании биохимических свойств к роду Proteus, подвергают серологическому типированию.

Определение сероваров возможно у P.vulgaris и P.mirabilis при помощи специфических О- и Н- сывороток в реакции агглютинации на стекле в соответствии с антигенно-диагностической схемой этих бактерий (в схеме представлены 49 серологических О-групп и 19 Н-антигенов) согласно приложению 22 к настоящей Инструкции и «Наставлениям по применению агглютинирующих протейных О- и Н- сывороток. Для реакции агглютинации используют суточную культуру на слабощелочным питательным агаре, которую испытывают вначале с поливалентными, а затем при положительной реакции агглютинации с моновалентными О-сыворотками, входящими в поливалентную. После установления О-группы определяют Н-антиген, применяя вначале поливалентные, а затем моновалентные Н-сыворотки.

При отсутствии диагностических Н-сывороток и необходимости решить вопрос однородны ли по Н-антигену выделенные штаммы (например, при определении источника инфекции в очаге) может быть использован феномен Диенеса. Для выявления феномена Диенеса чашку Петри с 2% слабощелочным питательным агаром делят пополам, на каждую половину среды (на полюсах диаметра чашки) засевают по 1 капле 4-5 часовой бульонной культуры, инкубируют при 37⁰С 18-20 ч. При наличии двух идентичных по Н-антигену штаммов отмечают слияние зон роста в результате «роения»; при различных Н-антигенах между обеими участками образуется разграничительная зона шириной 0,5-2 мм.

Разработаны антигенно-диагностические схемы других видов рода Proteus, Providencia и Morganella, но отсутствуют производственные диагностические сыворотки. В качестве эпидемических маркеров используют определение биоваров и чувствительность к антибиотикам. Дифференциация Providencia rettgeri на биовары согласно приложению 23 к настоящей Инструкции, дифференциация Providencia alcalifaciens и Providencia stuartii согласно приложению к 24 настоящей Инструкции.

 

ГЛАВА 7

VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS

Vibrio parahaemolyticus относится к роду Vibrio, семейству Vibrionaceae.

Vibrio parahaemolyticus - галофильный вибрион, вызывающий острые диареи. Вызванные им поражения часто регистрируются в странах Юго-Восточной Азии, Африки и Латинской Америки (до 20% всех диарей). Основные факторы передачи возбудителя инфекции – блюда из морских продуктов, длительно хранившихся в теплом месте и приготовленные с нарушениями технологического процесса. Реже наблюдаются поражения вызванные употреблением сырых моллюсков и рыбы. Возбудитель синтезирует энтеротоксин (гемолизин), вызывающий энтерит. Клинические проявления наблюдаются у 50% инфицированных лиц - характерны сильные боли в животе и водянистая обильная диарея, развивающаяся в течение 24 часов после инфицирования.

Заболевания наступают только при обильном обсеменении (более 10⁶ клеток в 1 грамме) пищи живыми клетками V. parahaemolyticus.

Энтеропатогенные штаммы V.parahaemolyticus, обнаруженные в выделениях больных, обладают гемолитическими свойствами, в то время как штаммы, выделенные из рыбы, послужившей причиной заболевания и из морской воды, не обладают этими свойствами. Этот феномен получил название по имени автора, его описавшего «Kanagawа»-феномен.

Vibrio parahaemolyticus – прмые или изогнутые грамотрицательные палочки (0,5-0,8х1,4-2,4мкм), полиморфные, подвижные, факультативно- анаэробные. Вибрион хорошо растет на обычных питательных средах, содержащих 2-3% NaCl. Оптимальная температура роста 30-37⁰С, оптимальный рН 7,5-8,8. Основные дифференциальные признаки V.parahaemolyticus и других галофилов согласно приложению 25 к настоящей Инструкции.

V.parahaemolyticus имеет три антигена О-, К-, Н-. Серологическая классификация основана на учете О- и К-антигенов, т.к. Н-антигены идентичны. О-антиген соматический, термостабильный, K-антиген капсульный и при 100⁰С разрушается. По структуре О-антигена бактерии разделеляют на 14 серогрупп, внутри их разделяют на 61 серовар по структуре К-антигенов. Серологическая идентификация с помощью реакции агглютинации проводится в соответствии с «Инструкцией по применению агглютинирующих сывороток».

Критериями диагностики заболеваний, вызванных V. parahaemolyticus, является обнаружение их в подозреваемом продукте в количестве 10⁶ и более клеток в 1 г (см³), с одновременным обнаружением того же типа возбудителя в кале пострадавших.

Бактериологические исследования.

Первый день. Из подготовленных к исследованию образцов (продук­ты и испражнения) готовят ряд десятикратных разведений в 3% пептонно-солевом бульоне, высевают по 0,1 мл на поверхность дифференциально-диагностической среды (висмут-сульфит агар с феноловым красным, тиосульфат-цитрат-желчно-сахарозный агар (ТСВS-агар.)). Засеянный материал тщательно втирают шпателем. Производят посев 1 мл неразведенного материала в 10 мл среды обогащения (висмут-сульфит солевой бульон). Посевы инкубируют при 37⁰С 18-24 часа.

Второй день. Просматривают чашки с первичными посевами. Типичные колонии V. parahaemolyticus на висмут-сульфит агаре с феноловым красным бесцветны, т.к. не ферментируют сахарозу, микроорганизмы, ферментирующие сахарозу, имеют темно-коричневый цвет, бактерии группы кишечной палочки на висмут-сульфит агаре с феноловым красным не растут, на ТСВS-агаре образуют оливково-зеленые колонии, на этой среде так же выявляют способность V. рarahaemolyticus утилизировать орнитин, в отличии от V. сholerae. Производят микроскопию в окрашенных по Граму препаратах и подсчет с последующим пересчетом на 1 г (см³) продукта, по общепринятой методике, 10 типичных колоний высевают на скошенный 2-3% солевой агар для дальнейшей идентификации.

Производят пересев со среды обогащения на висмут-сульфит агар с феноловым красным, или на ТСВS-агар так, чтобы получить рост изолированных колоний.

Третий день. Проверяют чистоту выделенных культур при микроскопии окрашенных по Граму препаратов. Пересевают чистые культуры со скошенного агара на: пептонный бульон без соли; пептонные солевые бульоны, содержание 6%, 8% и 10% NaCl; полужидкий агар для определения подвижности. Все посевы инкубируют при 37⁰С в течение 18-24 часов.

Четвертый день. Сравнивают рост культур на средах: пептонный бульон без соли и пептонно-солевые бульоны. V.рarahaemolyticus хорошо растет в солевом бульоне с 6-8% NaCl и не растет или растет очень слабо в бульонах без соли и с 10% NaCl. Определяют подвижность культур по характеру роста на полужидком агаре. Засевают 24-часовые агаровые культуры на среды Гисса, содержащие сахарозу и арабинозу, посевы инкубируют при 37⁰С в течение 18-24 ч, бульон с глюкозой для определения образования ацетилметилкарбинола, посевы инкубируют при 25-27⁰С в течение 48 часов.

Для определения энтеропатогенности выделенных галофилов по их гемолитическим свойствам производят пересев культур из солевого бульона по секторам на хорошо подсушенную чашку с кровяным солевым агаром (среда Wagatsuma). Инкубируют при 35⁰С 18-20 часов.

Пятый и шестой дни. Учет результатов ферментации углеводов. V.parahaemolyticus, как правило, не ферментирует сахарозу и ферментирует арабинозу.

Постановка реакции на ацетилметилкарбинол. К 1 мл бульонной культуры добавляют 0,6 мл 5% альфа-нафтола и после смешивания 0,2 мл 40% водного раствора щелочи (КОН). Розовое окрашивание, наступившее через 2-24 часа, указывает на наличие ацетилметилкарбинола.

Учет результатов наличия гемолиза определяют по зонам просветления среды вокруг колоний. V. parahaemolyticus, обладающий энтеропатогенными свойствами, вызывает гемолиз эритроцитов.

 

ГЛАВА 8

BACILLUS CEREUS

В.cereus – вид условно-патогенных бактерий рода Bacillus.

В.cereus почвенный микроорганизм широко распространенный во внешней среде - воде, воздухе и пыли помещений, на оборудовании предприятий пищевой промышленности и общественного питания. В.cereus обнаруживается в продуктах питания, где при благоприятных условиях размножается до количеств 10⁶-10⁷ в 1 г (см³) и может вызывать пищевые токсикоинфекции.

Низкая требовательность к условиям, необходимым для роста, приводит к тому, что В.cereus.может размножаться на любом продукте питания и любой продукт при его массивном обсеменении может привести к возникновению заболевания. В связи с В.cereus описаны отравления, вызванные мясными и рыбными продуктами, кондитерскими изделиями, растительными и молочными продуктами.

В мазках, окрашенных по Граму, В. cereus имеет вид крупных, грамположительных палочек, размером 0,5-2,5х1,2-10 мкм с слегка закругленными концами, лежащих в виде цепочек или штакетообразных скоплений, реже - отдельно друг от друга. Аэробы или факультативные анаэробы. В висячей капле подвижен, встречаются штаммы со слабо выраженной подвижностью и вовсе лишенные подвижности. На поверхности МПА образует крупные распластанные колонии белого цвета со слегка изрезанными краями. На средах с желтком колонии окружены широкой зоной глубокого равномерного беломатового коагулята (положительная реакция на лецитиназу). На полимиксиновых средах с ТТХ (2, 3, 5 трифенилтетразолий хлорид) колонии В. cereus зернистые, матовые, ярко рубинового цвета на фоне зоны белого коагулята. На кровяном агаре колонии В. cereus сероватой окраски, зернистые в отраженном свете, с перламутровым отливом в проходящем свете, окружены зоной гемолиза разной интенсивности. На столбике скошенного агара В. cereus дает сплошной белый рост, иногда мучнистого вида. На жидких питательных средах рост сопровождается помутнением бульона, образованием хлопьевидного осадка белого цвета (25-30% штаммов) и нежной белой пленки на поверхности среды. Все штаммы В. cereus створаживают молоко, частично пептонизируя его на 6-10 сутки. Около 85% штаммов разжижают желатин в течение 1-4 суток. Все без исключения штаммы В.cereus дают положительную реакцию на лецитиназу и ацетилметилкарбинол (р-ция Фогес-Проскауэра), расщепляют до кислоты глюкозу и мальтозу.

Оптимум роста для В.cereus 30⁰С, споры могут прорастать при широком интервале температур от 3-5⁰С до 70⁰С и давать рост при 6-55⁰С (около 4%), а при температуре 12-39⁰С достаточно интенсивный рост дают все штаммы данного микроорганизма. В. cereus способен давать рост в широком интервале рН от 4 до 12,5 и наиболее интенсивно от 7 до 9,5. Достаточно устойчив он к действию поваренной соли, сахара, поваренная соль задерживает размножение этого микроорганизма лишь при 10-15% содержании.

В. cereus легко и быстро образует споры. Содержание спор уже в 2-суточной культуре составляет до 50% от общего числа клеток. При этом споры В. cereus обладают достаточно высокой температурной устойчивостью и могут выживать не только при обычных методах технологической обработки пищи (варка, обжаривание, кипячение), но и при стерилизации молока и консервов.

Критериями диагностики заболеваний, вызываемых В. cereus, являются: обнаружение В. cereus в подозреваемом продукте питания в количестве не менее 10⁵ в 1 г (см³); обнаружение В. cereus в кале и рвотных массах или промывных водах желудка в количестве 10²-10³ в 1 г/мл; обнаружение В. cereus в кале большинства пострадавших при расследуемой вспышке пищевого отравления; обнаружение В. cereus при спорадических заболеваниях в кале пострадавшего только в острый период заболевания с последующим исчезновением к моменту выздоровления.

Бактериологические исследования клинического материала.

Первый день. Готовят исходные и ряд десятикратных разведений материала на ИХН. Производят посев разведений на поверхность солевого полимиксинового агара с 2,3,5-ТТХ или среду Никодемуса. Внесенный в чашки Петри посевной материал равномерно распределяют по поверхности питательной среды при помощи шпателя, после чего инкубируют при температуре 30-37⁰С от 24 до 96 часов. Посев производят согласно приложению 26 к настоящей Инструкции.

Второй день. Изучают морфологию выросших колоний, микроскопируют мазки, окрашенные по Граму, подсчитывают типичные колонии. Штаммы В. cereus на среде Никодемуса образуют крупные белые распластанные колонии со слегка изрезанными краями, окруженные широкой зоной глубокого белого равномерного матового коагулята или двойной зоной-коагулят и просветление. На солевом полимиксиновом агаре с 2,3,5-ТТХ они образуют ярко рубиновые колонии на фоне широкой зоны глубокого равномерного белого коагулята; колонии в первые часы роста - округлые, выпуклые, в дальнейшем (24-48 часов) распластанные на поверхности агара с изрезанными краями.

Для определения количества В. cereus, количество выросших типичных колоний на чашках умножают на соответствующее разведение и выражают в пересчете на 1 г/мл исследуемого материала.

Пересевают 3-5 колоний на скошенный агар. Инкубируют при 30-37⁰С 18-24 часа.

Третий день. Изучают характер роста на скошенном агаре, морфологию выросших культур в окрашенных по Граму препаратах и проверяют чистоту культуры. Проводят микроскопию висячей или раздавленной капли для установления подвижности культуры. В. cereus в отличие от В. аnthracis обладает подвижностью. Культуру засевают на «пестрый ряд», включающий глюкозу и маннит и на кровяной агар.

Для доказательства анаэробной ферментации глюкозы культуру со скошенного агара высевают уколом в питательную среду с индикатором бромкрезоловым пурпуровым и глюкозой.

Для определения способности ферментировать маннит культуру со скошенного агара пересевают на питательную среду с индикатором бромкрезоловым пурпуровым и маннитом. Посевы инкубируют при 30-37⁰С в течение 24 ч.

Культуру со скошенного агара пересевают на глюкозо-пептонный бульон рН 7,0 (для последующей постановки реакции на ацетилметилкарбинол). Посевы инкубируют при 30⁰С в течение 24 ч.

Четвертый день. Идентификация выделенных культур по «пестрому ряду» и кровяному агару. В. сereus ферментирует глюкозу и не ферментирует маннит. Для постановки реакции на ацетилметилкарбинол к 1 мл 24-часовой культуры на глюкозо-пептонном бульоне прибавляется 0,2 мл 40% водного раствора КОН и 0,6 мл раствора α-нафтола (α-нафтола 5 г, абсолютного этилового спирта 100 мл, раствор должен быть свежеприготовленным). Положительная реакция отмечается в виде розового окрашивания через 2-24 часа инкубации при 37⁰С.

Если при изучении культуральных морфологических и биохимических свойств микроорганизмов обнаружены подвижные, грамположительные, спорообразующие палочки, обладающие гемолитической активностью, образующие ацетилметилкарбинол, ферментирующие в анаэробных условиях глюкозу и не способные ферментировать маннит, то дают заключение об обнаружении В. сereus.

Пищевые продукты. С целью определения количества В. cereus в 1 г (см³) исследуемого продукта пробу продукта, или его разведения в объеме 0,1-0,2 см³ высевают поверхностным методом в две чашки Петри с солевым полимиксиновым агаром с 2,3,5-ТТХ. Посевы инкубируют при 30⁰С в течение 24-48 ч.

Через 24 ч посевы просматривают и выбирают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 колоний, характерных для В. сereus, характеристика колоний В. сereus приведена выше.

Через 48 ч уточняют число обнаруженных колоний. Корректировку подсчета количества В. сereus проводят после изучения морфологических и биохимических особенностей микроорганизмов из колоний характерных для В. сereus.