Генетические методы

Анализ генетических изменений может быть использован для оценки состояния среды. Появление таких изменений характеризует мутагенную активность среды, а возможность их сохранения в клеточных популяциях отражает эффективность иммунной системы организма.

В нормальных условиях большая часть генетических аномалий удаляется из популяции посредством иммунной системы организмов. Наличие таких аномалий можно использовать в качестве индикатора стресса, ведущего к продукции аномальных клеток и снижению способности иммунной системы организма их уничтожать. В качестве генетических изменений в соматических клетках обычно рассматривают различные структурные изменения хромосом, а также аномалии в количестве хромосом (анеуплоидию) и появление устойчивых анеуплоидных клонов [Софронов Е.А., Румак П.С. и др., 1999].

Наиболее часто употребляемым в оценке качества среды тестом является тест Эймса [Фонштейн, 1977; Котелевцев и др., 1986]. Для создания тест-системы Эймсом и его сотрудниками были сконструированы специальные штаммы. Все штаммы происходят от лабораторного штамма Salmonella typhimurium LT2, у которого были выделены ауксотрофные по гистидину мутанты his G-46 (мутация замены оснований в his G-гене гистидинового оперона), his C-3076 и his D-3052 (мутации типа сдвига рамки считывания в генах С и D соответственно).

На основе штаммов сальмонеллы были созданы полуколичественные и количественные тесты для оценки мутагенной активности. Как уже было отмечено выше, количественные тесты целесообразно использовать в целях определения частоты мутаций, а также в тех случаях, когда исследуемые вещества являются токсичными и вызывают гибель большей части клеток тест-объекта. Поэтому наиболее широкое распространение получил ставший классическим полуколичественный тест Эймса с метаболической активацией in vitro (или, как его иногда еще называют, тест Эймса сальмонелла/микросомы.

Принципиальная схема теста проста. В пробирку с расплавленным 0,6%-агаром вносятся определенные количества клеток тест-культуры испытываемого вещества, фракции S9 и кофакторов. В варианты без метаболической активации вместо фракции S9 вносят равный объем 0,15 М КСL. Полученная смесь выливается в качестве верхнего слоя на поверхность твердой среды, обеспечивающей селективный рост ревертантов His+. Через 2–3 дня проводится учет колоний ревертантов на чашках.

Оценка результатов производится исходя из следующих критериев. Если количество колоний на опытных чашках превышает число колоний на контрольных чашках без мутагена не более чем в 1,7 раза, делается заключение, что мутагенная активность не выявлена. Если наблюдается превышение в 1,7–10 раз, делается вывод о слабой, в 10–100 раз – о средней, более чем в 100 раз – о сильной мутагенной активности препарата [Фонштейн и др., 1977].

Для оценки теста Эймса сальмонелла/микросомы существенное значение имеет вопрос о совпадении канцерогенной и мутагенной активности проверяемых соединений, т. е. о чувствительности теста по отношению к канцерогенам. В опытах было показано, что 90% из 175 известных канцерогенов, выявленных в опытах на животных, проявили мутагенную активность в тесте на сальмонелле. Аналогичным образом, около 90% веществ, не проявляющих канцерогенной активности у животных, не вызывали обратных мутаций у сальмонеллы, хотя некоторая часть таких «неканцерогенов» была активна в тесте Эймса (так называемые «фальшивопозитивные результаты»). Считается, что это можно рассматривать как свидетельство его более высокой чувствительности по сравнению с тестами на животных. Следует отметить, что именно с использованием теста Эймса было проведено наиболее тщательное и систематическое сопоставление мутагенной и канцерогенной активности большого числа химических соединений.