Построение калибровочной кривой

Для построения калибровочной кривой используют чистые препараты белка, например, кристаллические препараты гемоглобина, бычьего сывороточного альбумина и другие.

Для приготовления исходного раствора белка отвесить 0,1 г стандартного белка и растворить в 100 мл дистиллированной воды. Раствор отфильтровать.

Точную концентрацию приготовленного раствора устанавливают по методу Кьельдаля. Для этого берут на сжигание в колбы Кьельдаля 3 пробы исходного раствора белка по 5 мл. приливают в колбу 7 мл концентрированной Н₂SО₄ d=1,84. Равномерное озоление пробы начинается уже при комнатной температуре, залитые навески оставляют на ночь. На следующий день колбы ставят на электроплитку и проводят постепенное сжигание в начале при слабом нагреве, затем при сильном, осторожно взбалтывая. Сжигание проводят в присутствии катализатора (2-3 мл перекиси водорода), до полного обесцвечивания раствора.

Содержимое колбы Кьельдаля количественно переносят горячей дистиллированной водой в мерную колбу на 500 мл, охлаждают, перемешивают и доводят раствор в колбе до метки.

Содержание в растворе аммония устанавливают по калибровочной кривой образцовых растворов. Для ее построения одновременно с испытуемым раствором готовят образцовые растворы. В мерные колбы на 100 мл помещают 0,2; 0,5; 1; 2; 4 мл рабочего образцового раствора NH₄Cl, затем 4 мл раствора сегнетовой соли, добавляют воды до половины объема, 4 мл реактива Несслера и доводят объем дистиллированной водой до метки.

Образцовый раствор NH₄Cl готовят растворением 0,7405 г химически чистого перекристаллизованного аммония хлористого в дистиллированной безаммиачной воде и доводят объем до 1 л, 20 мл этого раствора переносят в мерную колбу на 1 л, доводят объем до метки; 1 мл этого раствора содержит 0,005 мг NH₄⁺, его используют для приготовления образцовых растворов.

Просмотр окраски производят через 10 минут после прибавления реактива Несслера на приборе фотоколориметре: КФК-3 при длине волны λ=400 нм.

Содержание аммонийного азота рассчитывают по формуле:

где

- количество азота по графику, мг;

- общий объем раствора, мл (500);

Н – навеска, г;

С – объем раствора, взятый для окрашивания, мл (10).

При пересчете содержания азота на белок используют универсальный белковый коэффициент – 6,25.

Из исходного раствора методом разведения приготовить растворы с меньшим содержанием белка по приведенной схеме. Для этого условно принимают концентрацию исходного раствора белка за 100 единиц.

1. Исходный раствор – 100 ед. белка

2. 8 мл р-ра 1 + 2 мл Н₂О – 80 ед. белка

3. 7 мл р-ра 1 + 3 мл Н₂О – 70 ед. белка

4. 6 мл р-ра 1 + 4 мл Н₂О – 60 ед. белка

5. 5 мл р-ра 1 + 5 мл Н₂О – 50 ед. белка

6. 5 мл р-ра 2 + 5 мл Н₂О – 40 ед. белка

7. 5 мл р-ра 3 + 5 мл Н₂О – 35 ед. белка

8. 5 мл р-ра 4 + 5 мл Н₂О – 30 ед. белка

9. 5 мл р-ра 5 + 5 мл Н₂О – 25 ед. белка

10. 5 мл р-ра 6 + 5 мл Н₂О – 20 ед. белка

11. 5 мл р-ра 8 + 5 мл Н₂О – 15 ед. белка

12. 5 мл р-ра 10 + 5 мл Н₂О – 10 ед. белка

13. 5 мл р-ра 11 + 6 мл Н₂О – 5 ед. белка

Во всех приготовленных растворах провести определение белка по методу Лоури.

В качестве контроля использовать пробу, в которой вместо раствора белка была взята дистиллированная вода.

Результаты занести в таблицу 14.

Таблица 14.

Номер пробирки	Белок, усл. ед.	Белок, мг/л	Оптическая плотность (А)	Примечание

 

По полученным данным на миллиметровой бумаге построить калибровочную кривую в координатах «оптическая плотность – концентрация белка».

Калибровочная кривая используется для определения белка при выполнении работы.