Гетероциклические амины

Метод Эймса, предложенный в 1970-х, несмотря на свои значительные ограничения, обеспечил быстрый и недорогой способ анализа уровня канцерогенности химических веществ без вовлечения лабораторных животных и позволил увеличить скорость их очистки. Так, были довольно быстро протестированы компоненты табачного дыма и доказан их мутагенный эффект для бактерий. Далее был исследован дым, образующийся при приготовлении мяса, который также оказался сильным мутагеном. До этого, в 1939, было показано, что органические соединения, образующиеся в процессе жаренья лошадиного мяса, вызывают у мышей рак молочной железы, предположительно за счет формирования при этом ПАУ. В 1970-х эти исследования были продолжены. Появилось предположение, что источником канцерогенных агентов являются не ПАУ, а аминокислоты и белки, содержащиеся в мясе. При изучении этих компонентов был идентифицирован класс мутагенных гетероциклических аминов. Например, сильными мутагенами являются образующиеся изтриптофана агенты Trp-P-1 и Trp-P-2. Это послужило поводом для тщательного систематического изучения всех аминокислот. Гетероциклические амины образуются при пиролизе аминокислот, содержащихся в белках. Структуры некоторых гетероциклических аминов представлены на рис. 25. Другой важный класс мутагенов был идентифицирован при изучении смеси аминокислот с креатинином и моносахаридами. Эти ингридиенты содержатся в сыром мясе и гораздо более эффективны в комбинации, чем поодиночке, в отношении появления мутагенных свойств при приготовлении пищи. Для образования мутагенов критичной является температура приготовления пищи. Так, например, для формирования Trp-P-1 и Trp-P-2 требуются более высокие температуры, чем для дериватов фенилаланина, поэтому последние более широко распространены в США. Для снижения риска представляется возможным ограничение хорошо приготовленного и прожаренного мяса в пище. Очистку гетероциклических аминов и их мониторинг осуществляли, основываясь на предположении, что агенты, вызывающие мутации у бактерий, с большой вероятностью являются канцерогенами для животных. Мутагенная активность у многих из этих агентов очень велика. Несмотря на различия в уровне активности среди различных гетероциклических аминов, большинство из них являются более активными, чем даже такие мощные канцерогены животных, как афлатоксин В1 и бензо(а)пирен. Гетероциклические амины проявляют высококанцерогенные свойства по отношению к крысам и мышам. Особенного внимания заслуживают производные фенилаланина. Хотя ни один из них не является сильным бактериальным мутагеном, они в большом количестве содержатся в приготовленном мясе, и, например, проявляют высококанцерогенные свойства по отношению к грызунам. А в экспериментах на культурах тканей было показано, что эти соединения приводят к образованию аддуктов с ДНК, причем у людей в гораздо большей степени, чем у грызунов. У крыс они инициируют развитие опухолей кишечника, простаты и молочной железы. По предположению ряда исследователей, и у человека за развитие опухолей данной локализации гетероциклические амины ответственны в гораздо большей степени, чем жиры, содержащиеся в мясе и ранее рассматривающиеся как основной канцерогенный агент. В дальнейшем многие работы были посвящены оценке степени риска развития онкозаболеваний в зависимости от концентрации гетероциклических аминов в пище. В неметаболизированном виде гетероциклические амины не активны, не проявляют мутагенных и канцерогенных свойств. Их активация происходит при гидроксилировании аминогруппы. Гидроксиламин в некоторых случаях нестабилен и теряет воду с образованием активного иона, способного формировать аддукты с макромолекулами, такими, как ДНК и белки. Чаще гидроксиламин подвергается конъюгации с сульфатом или ацетатом. Такие конъюгаты подвергаются выведению из организма. Тканевая специфичность действия гетероциклических аминов связана, таким образом, с ферментами 1 фазы (гидроксилирование) и 2 фазы (конъюгация) метаболизма ксенобиотиков и с ферментами системы репарации ДНК. В клетке существует несколько ферментных путей, ответственных за превращение нитрогруппы в аминогруппу. Например, нитрогруппа может быть последовательно превращена в нитрозо, затем гидроксиламин и, наконец, в амины. Гетероциклические амины являются субстратами для цитохрома Р450 (главным образом для CYP1A2). Они подвергаются N–деалкилированию (в случае содержания N-алкильных групп) или N-гидроксилированию экзо-аминогрупп с образованием арилгидроксиаминов. Последние могут далее подвергаться действию N,O-ацетил- трансфераз или сульфотрансфераз. В результате образуются высокоактивные N-ацетокси- и N-сульфо-эфиры, которые образуют аддукты с ДНК. Эпидемиологические исследования показали строгую корреляцию между факторами питания и возникновением рака, причем некоторые сообщения предполагают взаимосвязь между потреблением пережаренного мяса и определенными типами рака человека. Некоторые гетероциклические амины класса аминоимидазоазарена (АИА) были изолированы из пережаренного мяса. Многие из них были мутагенами в тесте Эймса и канцерогенами для грызунов. Около 75% от всех гетероциклических аминов этого класса представлено 2-амино-1-метил-6-фенилимидазо[4,5b]пиридином (PhIP). Было показано, что это соединение вызывает рак грудной железы и кишечника у крыс и лимфому у мышей. Учитывая его канцерогенность для грызунов и высокое содержание в пище, можно предположить его потенциальную опасность в этиологии рака у человека. Для проявления генотоксичности таких соединений необходима метаболическая активация цитохромом Р450, особенно CYP1A2, в N-гидроксиметаболиты. Образовавшиеся в результате окисления метаболиты далее подвергаются О-ацетилированию N-ацетилтрансферазами NAT1 и NAT2, либо могут экскретироваться в виде глюкуронидов с желчью, проходя затем деконъюгацию, осуществляемую кишечной флорой, и окончательно выводятся из организма через О-ацетилирование кишечной формой NAT. Тогда одним из факторов, определяющим риск заболевания колоректальным раком, который, как предполагают, индуцируется этими токсинами, может быть активность ферментов детоксикации, т. е. NAT2. Доказано, что PhIP индуцирует более 32-х видов мутаций. Эпидемиологические исследования, проведенные в Китае, показали, что среди женщин, болеющих раком разной этиологии, 60% приходится на рак легкого, хотя большинство китайских женщин не курит. В связи с этим, интерес был сосредоточен на поиске других факторов, включая пассивное курение, дым против комаров, сгорание угля в домашних печах, масло для жарки пищи, которые могли бы влиять на столь высокий процент данной патологии. Был проведен множественный логистический регрессионный анализ факторов риска заболевания раком легкого на Тайване, который выявил существенную роль мутагенных-канцерогенных компонентов, образующихся в результате приготовления пищи. Были проанализированы аэрозольные компоненты пищи, образующиеся после жарки. Показано, что основным компонентом смеси пирогенных гетероциклических аминов является 2-амино-3,8-диметилимидазо[4,5-f]хиноксалин, обладающий высоким мутагенным потенциалом.

Мышьяк

Источники воздействия -Питьевая вода. Поверхность воды (реки, резервуары) в редких случаях может содержать высокий уровень мышьяка. -горнодобывающая и перерабатывающая промышленности. Руды ценных металлов часто содержат примеси мышьяка. Остаточные количества мышьяка могут загрязнять окружающую среду (включая воду) и вместе с пылью попадать в легкие. При плавке мышьяк высвобождается в воздух. -пестициды. Некоторые формы мышьяка (мышьяковистый натрий, монометил и диметил мышьяка) используются для уничтожения муравьев, грызунов, сорняков. - медикаменты. Ранее мышьяк применялся для лечения некоторых болезней, однако, сейчас его использование прекращено. Эпидемии из-за экспозиции высокой дозой из питьевой воды. - Тайвань. В течении более 50 лет люди в засушливых регионах пили воду с высоким содержанием мышьяка из колодцев, которые бурились для создания запасов воды. После того как среди популяции в 130 000 человек обнаружилось широкое распространение рака кожи, запасы воды пришлось заменить - Север Чили. В области вокруг Антофагасты население в 400 000 человек в течении 20-30 лет использовало речную воду с высоким содержанием мышьяка. В результате было отмечено большое количество рака кожи, мочевого пузыря и легких. - Индия и Бангладеш. Вода в этих регионах была настолько загрязнена, что в конце 1960-х правительству пришлось пробурить множество новых скважин, для обеспечения населения чистой водой. В 1980-е г. Начали отмечать большое количество рака кожи. Риску были подвергнуты несколько миллионов человек. Симптомы хронической экспозиции. -Гиперпигментация, пигментные пятна. - Гиперкератоз. Утолщение кожи на ладонях и стопах. Появляются наросты, подобные бородавкам. - Рак. Рак кожи преобладал в Тайваньской популяции в результате экспозиции мышьяком. Недавние исследования показали, что более вероятно может возникать рак мочевого пузыря. Замечено увеличение случаев рака легких. - Проблемы с циркуляцией крови. Клетки, окаймляющие кровеносные сосуды повреждаются при экспозиции мышьяком. В Тайване это приводило к случаям гангрены.Арсенит. Это соединение обладает высокой аффинностью к сульфгидрилам, особенно к вицинальным. Он является слабой кислотой и в норме ионизуется в биологических жидкостях, что способствует его прохождению сквозь мембрану путем диффузии. Арсенит быстро связывается с дигидролипоамидом, что сопровождается острой токсической реакцией. Это приводит к разрывам в цепи переноса электронов, восстановлению NAD+ + H+ до NADH и переносом ацетата на ацетил кофермент А, как показано на рис. 26. Рис. 26. Пируват дегидрогеназа (ПДГ), используя кофактор тиамин пирофосфат (TPP), превращает пируват в ацетил кофермент А. Дигидролипоил дегидрогеназа (ДЛДГ) генерирует ДГЛ 1,3-дитиол (показано стрелкой), отвечающий за связывание металлов. Е - фермент. Аффинность арсенита к вицинальным сульфгидрилам объясняет его способность к инактивации глюкортикоидных рецепторов в клетках в микромолярных концентрациях, без изменения остальных стероидных рецепторов. Только первый имеет вицинальный остаток цистеина в стероид-связывающей области. Как можно было бы ожидать, эта реакция ингибируется высокими концентрациями дексаметазона, высокоаффинного лиганда. Производное мышьяка, 2-хлорвинил дихлорарсин использовалось как химическое оружие. Антидотом для него является 2,3-меркаптопропанол. Это соединение связывается с арсенатом, однако обнаружено, что оно проходит через гемато-энцефалический барьер. Арсенат. Эта форма имеет геометрическое сходство с фосфатом, кроме того, она имеет аналогичную рКа и может транспортироваться в клетку с помощью переносчиков фосфата. Это соединение не обладает аффинностью к сульфгидрилам и поэтому значительно менее токсично для клеток. Но оно может вытеснять фосфат в метаболических реакциях, нарушая выработку энергии, как показано на рис. 27. Это соединение может формировать эфиры мышьяка с малыми молекулами, включая АДФ. Эти эфиры нестабильны и легко гидролизуются. Арсенаты хоть и являются слабыми мутагенами, но обладают заметной кластогенной (разрушающей хромосомы) активностью, возможно, вследствие низкого уровня формирования диэфиров мышьяка в остове ДНК. Метилированные аренаты. Это детоксифицированные формы, которые легко экскретируются у животных, почти не оказывая биологического эффекта (однако недавние исследования показали, что высокая доза этих соединений оказывает опухолегенный эффект). Концепция существования критического пути детоксикации привела к предположению, что может существовать безопасный способ выведения неорганического мышьяка. Некоторые эпидемиологи полагают, что присутствие менее 100 µМ мышьяка в питьевой воде не оказывает эффекта, и существующие стандарты по мышьяку можно повышать. Однако в недавних исследованиях, проведенных в Индии и Китае, был продемонстрирован биологический эффект дозы мышьяка менее чем 100 µМ. По-видимому, риск возникновения рака мочевого пузыря выше, чем риск возникновения рака кожи. Эпидемиологические исследования с учетом эффекта метилирования могут быть полезными в установлении стандартов для питьевой воды. Некоторые исследователи полагают, что риск возникновения мышьяк-индуцированного рака повышается при ингибировании реакций метилирования. Биологические воздействия мышьяка, предположительно способствующие канцерогенезу: Ответ на стресс. Обработка клеток мышьяком индуцирует некоторые белки теплового шока (heat-shock response), что приводит к изменениям в работе множества генов. Мышьяк индуцирует киназу стрессового ответа (JNK), однако в летальной концентрации 50 µМ. Допустимая концентрация менее 3 µМ не индуцирует эту киназу. Трансформация клеток. Показано, что при обработке мышьяком иммортализованных клеток грызунов в культуре последние приобретают морфологическое сходство со злокачественными клетками. Мышьяк предположительно действует как промотор поздних стадий рака у человека. Амплификация генов. Трансформированные клетки, обработанные антиметаболитами, часто развивают резистентность, аналогичную той, что имеет место при химиотерапии. Показано, что иммортализованные клетки мышей линии 3Т6 развивают резистентность к метотрексату (ингибитор дигидрофолат редуктазы) путем амплификации ДНК, кодирующей фермент-мишень. Скорость амплификации стимулируется арсенитом или (в больших концентрациях) арсенатом. Предполагается, что арсенит дестабилизирует репарацию ДНК, действуя как опухолевый промотор. Показано, что арсенит ингибирует ДНК-лигазу, однако в очень высоких (летальных) концентрациях.

ТХДД

При исследованиях регуляции токсичных процессов большой интерес представляет соединение, известное как диоксин или 2,3,7,8-тетрахлородибензо-р-диоксин (ТХДД) (Рис. 28). Рис. 28. Структура 2,3,7,8-тетрахлодибензо-p-диоксина Это сильнодействующее соединение, оказывающее вредное воздействие на многие виды животных. ТХДД образуется при нагревании хлорированных фенолов или при горении хлорсодержащих углеводородов, входящих в некоторые виды пластика. В окружающей среде в заметных количествах ТХДД обнаруживается со времен 2-ой мировой войны в связи с развитием нефтеперерабатывающей промышленности. В прошлом большое количество ТХДД выбрасывалось в окружающую среду в результате аварий на производстве, связанном с хлорированием фенолов и, как загрязнения, при рутинном синтезе хлорированных фенольных продуктов (определенные гербициды). В малых количествах ТХДД обнаруживается как побочный продукт при хлорировании органических материй (отбеливание бумаги). Однако по оценкам экспертов половина ТХДД, генерируемого ежегодно в США, образуется в результате сгорания отходов. Горение при достаточно высоких температурах приводит к распаду ТХДД, однако такая температура обычно не достигается. ТХДД известен как сильный канцероген для ряда видов животных. У мышей, крыс, хомячков, рыб, обрабатываемых длительное время этим соединением, быстро развиваются опухоли. Некоторые исследователи полагают, что ТХДД является первичным промотором, вызывая рак при кормлении в течение длительного периода. Они полагали, что это соединение просто усиливает развитие опухолей, возникающих из-за эндогенных повреждений ДНК. Идея была привлекательна, поскольку сам по себе ТХДД не взаимодействовал с ДНК и не образовывал аддукты. Более того, биотрансформация ТХДД происходит слабо, и высоко реакционноспособные метаболиты не образуются с необходимой скоростью. ТХДД не является промотором в общем случае, он неэффективен для самцов крыс и некоторых видов мышей. Помимо рака ТХДД оказывает ряд негативных эффектов. В организме человека он метаболизируется с образованием хлорина, который удерживается от 5 до 20 лет, а сам ТХДД удерживается в жировой ткани и выводится медленно. Время его полувыведения оценивается в 1 год и более. У мышей во время внутриутробного развития он вызывает появление расщепленного неба. Также это соединение препятствует созреванию Т-лимфоцитов в тимусе, т.е. ТХДД является иммуносупрессором. Среди разных видов животных существует ярко выраженная дозо-зависимость: например, у морских свинок LD50 составляет 2 мкг/кг веса, а у хомячков более 5000 мкг/ кг веса. В табл. 6 приведены данные о чувствительности разных видов к токсину: Табл. 6. Чувствительность к ТХДД

ВИД	Способ передачи	LD50 (мг/кг)	ED50 (мг/кг)
Свинья	перорально		0.5-1
Обезьяна	перорально
Крыса	через легкие	25-60
Кролик	перорально
	через кожу
Мышь	через легкие
Хомяк	через легкие	>3000	>300
	перорально

Диоксин является мощным индуктором цитохрома Р450 1А1 и токсичен для репродуктивной системы. Репродуктивные эффекты ТХДД имеют особое значение. Около 20 лет назад было показано, что незначительная доза ТХДД с пищей приводит к бесплодию у резус-макак. У самок резус-макак, получавших ТХДД, развивался эндометриоз, причем эндометриальные клетки обнаруживались и вне матки, в брюшной полости. ТХДД предотвращает эстроген-зависимый рост клеток карциномы молочной железы в культуре. В отсутствие твердых доказательств и информации о механизме действия приходится допускать значительный разброс в оценке риска. Используя правдоподобную оценку эффективности ТХДД как канцерогена у грызунов и производя линейную экстраполяцию для подсчета риска возникновения рака у человека, можно получить величину дневной дозы ≈ 10пкг. Напротив, если существует пороговая величина для действия ТХДД (характерная для промоторов рака), то уровень допустимой дневной дозы может составлять ≈ 500пкг. В настоящее время известно, что ТХДД связывается со специфическим рецепторным белком (Ah рецептор) в цитоплазме клетки, который затем мигрирует в клеточное ядро и стимулирует транскрипцию определенных генов (возможно репрессируя транскрипцию других). Показано, что этот внутриклеточный рецептор взаимодействует с гормонами (эстроген, прогестерон, тестостерон, гидрокортизон и другие), витаминами (A, D) и другими малыми молекулами (некоторые липиды), причем каждое соединение взаимодействует специфичным образом. Принимая это во внимание, можно предположить, что ТХДД стимулирует синтез таких соединений или белков, которые меняют поведение клетки, что в итоге ведет к появлению ответа на токсичность. Идентификация таких белков, которые могут сильно варьировать в зависимости от ткани, может быть большим шагом вперед. ТХДД может оказывать негативные эффекты на здоровье не прямо, а через метаболическую чувствительность. Этот сценарий действия отличается от транскрипционного. Во многих тканях ТХДД стимулирует синтез CYP1A1, 1A2, 1B1 и, возможно, других изоферментов цитохромов Р450. Они, в свою очередь, метаболизируют имеющиеся субстраты, приводя к появлению токсичных интермедиатов, которые повреждают ДНК и меняют поведение клетки. Исходя из этого, можно объяснить чувствительность самок, но не самцов крыс к развитию рака печени. У самок цитохромы Р450 1А1 и 1В1 метаболизируют эстроген с образованием катехолов, которые далее могут окисляться до хинонов и образовывать супероксид. Хиноны могут формировать аддукты с ДНК, а супероксид (как и другие реакционноспособные радикалы кислорода) могут окислять основания ДНК. Известно, что сам хинон чувствителен к окислению, и, действительно, введение ТХДД приводит к повышению уровня окисленного хинона в печени самок, но не самцов крыс. Также было отмечено, что предварительная обработка ТХДД культур клеток делает их чувствительными к токсичным эффектам проканцерогенов, активируемых цитохромами Р450, но которые сами по себе являются слабыми индукторами. Для объяснения некоторых эффектов ТХДД был предложен альтернативный сценарий, включающий Ah-рецептор, но не транскрипция генов напрямую. Так, лиганд-рецепторный комплекс с некоторыми гормонами может влиять на генную экспрессию, стимулированную другими факторами транскрипции. Этот эффект имеет место на уровне белковых факторов, связывающихся друг с другом. Такой подход представляется правдоподобным, поскольку внутриклеточные рецепторы часто существуют в виде гетеродимеров (например, тиреоидный гормон обычно связывается с рецептором, состоящим из 2-х субъединиц, одна из которых непосредственно связывает гормон, а вторая – ретиноевую кислоту). Сообщалось, что в культурах клеток ТХДД препятствовал нормальному связыванию не только гидрокортизона, но и ретиноевой кислоты. Некоторые исследователи полагают, что ТХДД дополнительно может запускать определенные метаболические пути с участием киназ, влияющих на многие свойства клетки. И хотя некоторые детали механизма, благодаря которому комплекс ТХДД-Ah-рецептор оказывает токсичное действие, еще предстоит уточнить, знания о том, что эффекты ТХДД опосредуются рецептором, позволяют уточнить дозо-зависимые отношения. Степень ответа регулируется степенью занятости Ah-рецептора лигандом (т.е. ТХДД). Согласно определению, рецептор занят на 50%, когда концентрация лиганда равна константе диссоциации (Kd) рецептора. Исследования на стероидных гормонах, действие которых опосредовано рецептором, показали, что изменения концентрации гормона более чем в 10 раз превышающие Kd, оказывают слабый биологический эффект вследствие насыщения рецептора. Аналогично, когда концентрация гормона составляет одну десятую или менее от величины Kd, количество занятых молекул рецептора недостаточно для оказания заметного биологического эффекта. Центром области концентраций, при которых наблюдаются ожидаемые эффекты, является величина Kd, а границы области составляют величины от 10 раз больше до 10 раз меньше Kd. Для Ah-рецептора человека величина Kd составляет 0.1-1нМ. Следовательно, доза ТХДД, составляющая менее 1пкМ, которая дает эффективное связывание с рецептором, не окажет вреда. Такую дозу можно определить, эмпирически, исследуя отношение между вводимой дозой и индукцией Р450 1А1 на животных. Проводя такого рода анализ, необходимо помнить о сделанных допущениях. Во-первых, предположение, что лиганд в количестве ниже, чем 10% от Kd биологически неактивен, иногда сомнительно. В некоторых системах (ацетилхолиновый рецептор в нейро-мышечном синапсе) по-видимому, существуют «резервные» рецепторы. Это предположение исходит из наблюдений, что кривая зависимости ответа от дозы сдвигается к более низким, чем ожидалось концентрациям. Максимальный ответ получался с единственной занятой фракцией рецептора, и более низкая концентрация имеет пропорционально больший эффект, чем ожидалось. Эту проблему следует принимать во внимание при оценке риска. Во-вторых, можно допустить, что не все эффекты ТХДД требуют участия рецептора, хотя наиболее значимые действительно являются опосредованными. Делается заключение, что ТХДД является столь эффективным ввиду того, что он обладает высокой аффинностью по отношению к Ah-рецептору и долго не выводится из клетки. Другой продукт сгорания - хлорированный дибензофуран обладает такими же свойствами. Существует множество других лигандов для Ah-рецептора, среди которых полициклические углеводороды и планарные полихлорированные бифенилы. Однако, существуют и менее известные соединения, которые связываются с рецептором и активируют транскрипцию цитохрома Р450 1А1, включая индол-3-карбинол, который встречается в некоторых употребляемых в пищу растениях. Существует множество тестов для оценки специфичности связывания с Ah-рецептором. По аналогии со стероидными гормонами оказалось, что действие многих токсичных соединений (к их числу относятся и лекарства в случае неправильного употребления) направлено на определенные рецепторы. Некоторые исследователи высказывают предположения о существовании эндогенных лигандов к Ah-рецептору. Полагают, что этот рецептор необходим для функционирования клеток в норме, поскольку нокаутные по этому рецептору мыши имели дефекты печени и возможно других тканей. Поиск эндогенных лигандов и их идентификация помогут пролить свет на механизм действия ТХДД.