ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АМИНОКИСЛОТ В ПЕПТИДАХ И БЕЛКАХ
Задачи, на решение которых направлено определение первичной структуры пептидов и белков. Корреляция между структурой и биологической активностью белков. Общая стратегия определения первичной структуры белков. Основные этапы определения последовательности аминокислот в белках: выделение белка; получение кислотного гидролизата белка и определение мольного соотношение входящих в него аминокислот; определение молярной массы и вычисление количества всех присутствующих аминокислотных остатков; определение количества входящих в молекулу полипептидных цепей; разделение полипептидных цепей и расщепление каждой из них на фрагменты; секвенирование пептидных фрагментов. Метод перекрывающихся блоков и метод неполного гидролиза – основные подходы для восстановления порядка расположения фрагментов в исходной цепи белка. Определение состава белковых олигомеров: получение мономеров и полипептидных цепей. Методы идентификации олигомеров: электрофорез в полиакриламидном геле, гель-фильтрация. Идентификация индивидуальных полипептидных цепей. Определение состава олигомера по молекулярным массам мономеров. Определение числа мономеров в олигомере путем “сшивания” субъединиц бифункциональными реагентами. Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методами. Гидролиз сериновыми протеазами. Механизм. Использование химических методов для изменения специфичности ферментативного гидролиза. Фрагментация полипептидов химическими методами. Частичный кислотный гидролиз. Расщепление связи Asp-Pro. N®O-ацильная миграция. Бромциановый метод расщепления по остаткам метионина. Расщепление пептидной связи по остатку триптофана. Окислительное галогенирование. Расщепление с помощью BNPS-скатола. Расщепление о -иодозобензойной кислотой. Расщепление пептидной связи по остатку тирозина. Расщепление с помощью N -бромсукцинимида и N -иодосукцинимида. Расщепление по остатку цистеина. Цианирование с помощью 2-нитро-5-тиоцианобензойной кислоты. Превращение цистеина в дегидроаланин с последующим расщеплением пептидной связи по a-углеродному атому дегидроаланилпептида. Другие методы расщепления пептидных связей. Расщепление связи Asn-Gly гидроксиламином. Расщепление по остатку гистидина под действием N -бромсукцинимида. Расщепление дисульфидных связей. Определение аминокислотного состава. Исчерпывающий гидролиз белков для аминокислотного анализа. Колоночная хроматография аминокислот. Постколоночная и предколоночная модификация. Газожидкостная хроматография аминокислот. Этерификация карбоксильных групп и ацилирование других реакционноспособных групп с целью получения летучих производных аминокислот. Определение триптофана в интактном белке. Методы идентификации модифицированных аминокислотных остатков. Анализ фосфорилированных аминокислот и g-карбоксиглутаминовой кислоты. Определение ацетильной и формильной группы. Анализ остатков амидов дикарбоновых кислот. Идентификация N- и C-концевых аминокислотных остатков. Реагент Сэнгера для определения N -концевой аминокислоты. Дансилирование. Определение С -концевых групп. Селективное введение трития. Гидразинолиз. Определение С -концевых аминокислот путем алкоголиза оксазолов. Методы анализа аминокислотной последовательности пептидов. Метод Эдмана для секвенирования пептидов. Определение последовательности пептидного фрагмента в ручном варианте. Автоматический анализ аминокислотной последовательности: жидкофазный вариант секвенатора; газофазный вариант секвенатора; твердофазный вариант секвенатора. Методы присоединения пептидов к носителю. Применение масс-спектрометрии при определении первичной структуры пептидов и белков. Масс-спектрометрческий анализ смеси пептидов, образующихся при специфическом гидролизе белка. Банки данных для последовательностей аминокислот в белках. MS/MS-секвенирование. Особые случаи применения метода. Пептиды с защищенной Установление первичной структуры белков по кодирующей последовательности в ДНК. Скрининг банков генов. Секвенирование кодирующей последовательности. Сопоставление структуры пептидов с кодирующими последовательностями. Анализ посттрансляционного процессинга методом масс-спектроскопии. Идентификация и локализация цистинсодержащих пептидов. Расщепление дисульфидных связей. Выделение тиолсодержащих пептидов ковалентной хроматографией. Выделение цистинсодержащих пептидов методом диагонального электрофореза. Идентификация по известной аминокислотной последовательности. Идентификация дисульфидных связей у белков с неизвестной аминокислотной последовательностью.
|
