ХИМИЧЕСКИЙ И ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ НЕПРИРОДНЫХ АНАЛОГОВ

Методы образования фосфодиэфирной связи:химические и ферментативные методы синтеза. Фосфодиэфирный и фосфотриэфирный методы синтеза олигонуклеотидов. Твердофазный фосфотриэфирный метод синтеза олигонуклеотидов (амидофосфитный вариант). Н-фосфонатный синтез олигорибонуклеотидов.

Защита функциональных групп. Характер защитных групп при химическом синтезе олигонуклеотидов. Основные требования к защитным группам. Блокирование и деблокирование аминогрупп гетероциклических оснований: ацетильная, бензоильная, изо бутирильная и N,N -диметилформамидодиметилацетильная защиты. Основные способы введения и удаления защитных групп, механизмы соответствующих процессов. Блокирование и деблокирование гидроксильных групп остатков пентозы: диметокситритильная защита (5’-ОН-группы); ацильная (3’-ОН-группы); трет -бутилдиметилсилильная и триизопропилсилилоксиметильная защиты (2’-ОН-группы). Основные способы введения и удаления защитных групп, механизмы соответствующих процессов.

Приготовление нуклеозидного (ОН-компонента) и нуклеотидного (Р-компонента) компонентов. Введение защитных групп в нуклеозиды. Получение нуклеотидного компонента через фосфорилирвание нуклеозида соединениями трехвалентного фосфора. Ненуклеозидные амидофосфиты для введения в олигонуклеотиды различных групп: 5'-фосфата, аминогруппы, меркаптогруппы, альдегидной и карбоксильной групп, алкиновых фрагментов, флуоресцентных красителей и тушителей, гидрофильных и гидрофобных модификаций, биотина. Способы присоединения первого нуклеозидного остатка к полимерному носителю и снятия синтезированного олигонуклеотида с полимера. Универсальные, нуклеозидные и специальные носители.

Схема синтеза фосфодиэфирной связи твердофазным амидофосфитным методом. Образование связи между Р- и ОН-компонентами. Роль тетразола. Стадия кэпирование. Окисление фосфиттриэфирного фрагмента. Цикличность синтеза на полимере как основа для автоматизации. Выделение, очистка и идентификация синтетических олиго- и полинуклеотидов.

Схема синтеза фосфодиэфирной связи твердофазным H-фосфонатным методом. Две стадии синтетического цикла: удаление диметокситритильной защиты и конденсация. Использование нуклеозидных H-фосфонатов в качестве строительных блоков, а пивалоилхлорида, 2,4,6-триизопропилбензолсульфонилхлорида и других соединений – в качестве активаторов. Окисление H-фосфонатной диэфирной связи между нуклеозидами в фосфодиэфирные связи.

Тиофосфатные олигонуклеотиды. Схема синтеза твердофазным H-фосфонатным методом. Реакции кэпирования и сульфурирования.

Пептидные, морфолиновые и конформационно-ограниченные аналоги олигонуклеотидов. Схемы синтезов. Стадии для получения мономеров аналогов олигонуклеотидов, у которых углеводный фрагмент заменен на кольцо морфолина: последовательное окисление цис -диольной группы периодатом, обработка аммиаком для замыкания в морфолиновый цикл, восстановление вторичных ОН-групп боргидридом натрия, защита атома N-морфилинового цикла тритильной группой, введение по первичной ОН-группе хлордиметиламидофосфорильной группы. Селективное алкилирование по атомам азота в пуринах и пиримидинах и последующее ацилирование – ключевые шаги в синтезе пептидных аналогов.

Химико-ферментативный синтез фрагментов ДНК. Клонирование синтетических полидезоксирибонуклеотидов. Два подхода к получению двухцепочечных полинуклеотидов: использование для соединения отдельных фрагментов реакции, катализируемой Т4 ДНК-лигазой; применение репаративной достройки частичного дуплекса с помощью ДНК-полимеразы. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) как вариант амплификации двухцепочечных полинуклеотидов. Введение реакционноспособных и репортерных групп при матричном синтезе ДНК и РНК.

Создание микрочипов. Одновременный синтез набора олигонуклеотидов на твердой подложке с использованием фотолабильной временной защиты.

Молекулярная селекция (SELEX). Библиотеки олигонуклеотидов. Аптамеры, схемы получения и применение. Каталитические РНК и ДНК.