Молекулярно-ситовая хроматография

Воснове этого варианта хроматографии лежит прин­цип разделения смеси веществ по их молекулярным разме­рам или молекулярным массам. Его называют также гель-фильтрацией или гель-хроматографией. Метод широко ис­пользуют для выделения и очистки биополимеров - белков, пептидов, поли- и олигосахаридов, нуклеиновых кис­лот и даже клеток, например, тромбоцитов.

В качестве носителей в молекулярно-ситовой хромато­графии используются различные гели с трехмерной сетча­той структурой - декстрановые (сефадекс), полиакриламидные (биогель Р), агарозные (сефароза) или на основе стирола и дивинилбензола, простые силикагели, а также пористые стеклянные гранулы. Все гели и стекла имеют поры строго определенных размеров, по возможности, не содержат ионогенных групп и не обладают химическим или биологическим сродством к анализируемым вещест­вам. Гелями называют дисперсные системы с жидкой или газообразной дисперсионной средой, в которой частицы твердой дисперсной фазы связаны между собой молеку­лярными силами сцепления различной природы.

Молекулярно-ситовая хроматография может быть вы­полнена в колоночном и тонкослойном вариантах. Пре­имущество отдают колоночному варианту.

Если набухшие гранулы декстранового геля (сефадекса) поместить вместе с растворителем в вертикальную ко­лонку и внести на поверхность смесь веществ, то разделе­ние смеси веществ происходит за счет того, что в поры ге­ля могут проникать только вещества, размеры молекул которых не превышают размеров пор. В результате диф­фузий (проникновения) внутрь пор геля молекулы мень­шего размера элюируются с геля позже, чем более круп­ные молекулы, не проникающие в поры геля (рис.24.12).

 

Рис. 24.12. Схема опыта по молекулярно-ситовой

хроматографии.

(Показано более быстрое продвижение крупных молекул

белка.)

• - большие молекулы; О - поры геля; • - малые молекулы

 

Декстрановые и полиакриламидные гели широко исполь­зуются для освобождения органических веществ, от ионов неорганических солей. Для обессоливания белков подбира­ют мелкопористые сефадексы. Высокомолекулярные веще­ства (ВМВ) (белки, полисахариды) не проникают в поры этих сефадексов, а неорганические соли, наоборот, проникают. При добавлении растворителя в колонку ВМВ выходят из нее первыми, а соли выходят из колонки значительно позже.

Молекулярно-ситовая хроматография применяется и для определения молекулярных масс белков.