Аффинная (биоспецифическая) хроматография
Аффинная хроматография - это метод очистки и разделения белков, основанный на их избирательном взаимодействии с лигандом, ковалентно связанным с инертным носителем (иммобилизованный лиганд). В качестве лигандов используют соединения, взаимодействия которых с разделяемыми веществами основано на биологической функции последних. Так, при разделении ферментов лигандами служат их субстраты, ингибиторы или коферменты. Главная особенность, которая обусловливает высокую эффективность аффинной хроматографии, состоит в том, что разделение основано на различии не физико-химических признаков молекулы (заряда, формы и размера), а специфических функциональных свойств, отличающих данный фермент от множества других биополимеров. Схематически (рис. 24.13) процесс разделения веществ с помощью аффинной хроматографии можно представить следующим образом. Колонку заполняют носителем, прочно связанным с каким-нибудь биологически активным веществом (лигандом). Пропускают через колонку анализируемую смесь веществ, к одному из которых лиганд обладает биологическим сродством. Лиганд из всей смеси веществ выбирает «свое» вещество и образует с ним биоспецифический комплекс. В результате этого вещество останется в колонке связанным с лигандом, а все остальные компоненты смеси пройдут через колонку, не задерживаясь. После этого можно изменить буферный раствор, подобрав условия, при которых комплекс лиганда с избранным им веществом распадается и чистое вещество вымывается этим буферным раствором из колонки.
Рис. 24.13. Механизм аффинной хроматографии: _ Л - лиганд; Л — иммобилизованный лиганд; М — биологически _ активное вещество; МЛ - биоспецифический комплекс; ∆ - примеси; О - несорбирующиеся компоненты смеси
В настоящее время метод аффинной хроматографии применяется для выделения и очистки многих природных белковых молекул (антител, антигенов, ингибиторов, ферментов, гормонов, клеточных рецепторов), специфических пептидов, гликопротеидов и гликолипидов, полисахаридов, моносахаридов, нуклеиновых кислот и нуклеотидрв, липидов, субклеточных частиц и многих видов клеток.
ВОПРОСЫ 1. Что такое хроматография? 2.Какие признаки положены в основу классификации хроматографических методов? 3. Что положено в основу адсорбционной хроматографии? 4. Какие адсорбенты, и растворители применяются в адсорбционной хроматографии? 5. От каких факторов зависит молекулярная адсорбция из растворов? 6. Где используется молекулярная адсорбция? 7. Что такое коэффициент распределения? 8. Какие варианты газовой хроматографии вы знаете? Что используется в газовой хроматографии в качестве подвижной фазы? 9. Из каких основных частей состоит газовый хроматограф? 10. Что такое хроматограмма? 11. Как проводится анализ веществ методом тонкослойной хроматографии? 12. Как обнаруживаются разделяемые вещества в тонком слое сорбента и каким образом затем количественно определяются? 13. Что используется в качестве носителя неподвижной жидкой фазы в бумажной хроматографии? 14. Какие виды бумажной хроматографии различают в зависимости от техники выполнения? 15. Что такое иониты? Напишите реакции ионного обмена на ионитах. 16. В каких отраслях народного хозяйства применяются иониты? 17. С какой целью используется молекулярно-ситовая хроматография? 18. Что применяется в качестве носителей в молекулярно-ситовой хроматографии? 19. Какова главная особенность аффинной хроматографии в отличие от других хроматографических методов? 20. Для выделения и очистки каких веществ используется метод аффинной хроматографии?
ОТВЕТЫ НА ВОПРОСЫ ТЕСТОВОГО САМОКОНТРОЛЯ
|
