Техника выполнения

Подготовка образца. Хлебные изделия разрезают на четыре части по двум взаимно перпендикулярным направлениям. Затем берут две диаметрально противоположные четверти, которые разрезают ножом на небольшие ломтики. Последние пропускают через мясорубку или тщательно измельчают ножом. Измельченную пробу тщательно перемешивают.

Приготовление основного стандартного раствора рибофлавина. Навеску рибофлавина массой 0, 020 г помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³, добавляют 750 см³ дистиллированной воды и 1 см³ ледяной уксусной кислоты и слегка нагревают для лучшего растворения. После полного растворения рибофлавина раствор охлаждают до комнатной температуры и доводят объем дистиллированной водой до метки. Приготовленный раствор переносят в склянку из темного стекла с притертой пробкой. Концентрация основного стандартного раствора рибофлавина составит 20мкг/см³. Раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.

Приготовление рабочего стандартного раствора рибофлавина. 7…10 см³ основного стандартного раствора рибофлавина помещают в химический стакан и выдерживают в темном месте до приобретения раствором комнатной температуры. Затем 5 см³ основного стандартного раствора рибофлавина переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят объем дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Концентрация рабочего стандартного раствора рибофлавина составит 1 мкг/см³. Раствор готовят в день проведения анализа.

Гидролиз. Рибофлавин определяют в двух параллельных навесках продукта. Масса навески должна обеспечить концентрацию рибофлавина в измеряемом растворе в диапазоне 0, 04…0, 25 мкг/см³, что при данных навеске и разведениях будет соответствовать содержанию рибофлавина в продукте 0, 10…0, 60 мкг/100 г. Навеску продукта массой 10 г помещают в колбу вместимостью 250 см³ и приливают 150 см³ раствора соляной кислоты концентрации 0, 1 моль/дм³. Гидролиз осуществляют на кипящей водяной бане в течение 40 мин, закрыв горло колбы воронкой диаметром 35 мм. Содержимое колбы следует периодически перемешивать, особенно в первые 5 мин. По окончании гидролиза колбу охлаждают до комнатной температуры и с помощью насыщенного водного раствора уксуснокислого натрия доводят рН гидролизата до 4, 5± 0, 1 (потенциометрически). После этого к гидролизату добавляют навеску амилоризина массой 0, 10 г, 2…3 капли толуола и затем колбу помещают в термостат на 14…16 часов при температуре 37 ⁰С. После этого гидролизат охлаждают, доводят его объем до 250 см³ и фильтруют. Одновременно аналогичным образом готовят контрольный раствор на содержание рибофлавина в амилоризине. Используя то же количество ферментного препарата и реактивов, но без навески исследуемой пробы. До проведения анализа фильтрат хранят в холодильнике в плотно закрытой колбе.

Очистка гидролизата от примесей, мешающих определению. К 100 см³ фильтрата добавляют 2 см³ раствора серной кислоты концентрации 0, 3 г/см³ и с помощью пипетки или бюретки по каплям раствор марганцовокислого калия концентрации 0, 03 г/см³, постоянно перемешивая до получения малинового окрашивания. Избыток марганцовокислого калия удаляют добавлением по каплям раствора перекиси водорода до обесцвечивания фильтрата. Количество израсходованных растворов серной кислоты, марганцовокислого калия и перекиси водорода (в кубических сантиметрах) приплюсовывают к первоначально взятому на окисление объему фильтрата, чтобы определить конечный объем раствора. Полученный раствор переносят в делительную воронку, добавляют 30…50 см³ хлороформа и встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев хлороформный слой (нижний) отбрасывают, а водную фазу используют для дальнейшего определения.

Фотолиз. Фотолиз проводят в пяти конических колбах с притертыми пробками. В четыре колбы наливают по 20 см³ очищенного гидролизата, в две из которых добавляют по 2 см³ рабочего стандартного раствора рибофлавина. В пятую колбу наливают 20 см³ контрольного раствора. Во все пять колб добавляют по 4 см³ раствора гидрооксида натрия концентрации 7 моль/дм³, закрывают колбы пробками, перемешивают содержимое и облучают их светом двух светильников с лампами накаливания по 100 ват каждая с расстояния 30 см в течение 40 мин. Температура окружающего воздуха должна быть не более 25 ⁰С. Для поддержания указанной температуры воздуха используют настольный вентилятор. Немедленно по окончании облучения растворы во всех колбах подкисляют 4 см³ ледяной уксусной кислоты, добавляют к ним по 20 см³ хлороформа, закрывают притертыми пробками и встряхивают в течение 2 мин, избегая образования эмульсии. Затем все колбы оставляют на 10…15 мин для расслоения водной и хлороформной фаз. После этого пипеткой отбирают 10…12 см³ хлороформного раствора (нижний слой), который фильтруют через бумажный фильтр с безводным сернокислым натрием в флюорометрические пробирки. Время с начала фильтрации раствора люмифлавина до измерения его флюорисценции не должно превышать 30 мин.

Измерение флюоресценции хлороформного раствора. При работе на флюорометре марки ЭФ–ЗМА устанавливают светофильтры для витамина В₂. При работе на флюорометре марки ФМ–Ц–2 устанавливают светофильтры, дающие длины волн возбуждения и флюорисценции 450 и 550 нм соответственно. Измерение интенсивности флюорисценции растворов осуществляют по отношению к хлороформу. При работе на флюорометрах других марок интенсивность флюорисценции измеряют при светофильтрах, дающих длины волн возбуждения в области 350…480 нм, флюорисценции – 475…650 нм.

Расчет:

Массовую долю рибофлавина продукта, вычисляют по формуле:

, или

 

где: A – интенсивность флюоресценции испытуемого раствора без добавления стандартного раствора рибофлавина, среднее из двух параллельных определений, ед. прибора;

A₁ – интенсивность флюоресценции контрольного раствора, ед. прибора:

A₂ – интенсивность флюоресценции испытуемого раствора с добавлением стандартного раствора, рибофлавина среднее из двух параллельных определений, ед. прибора;

X₁ – массовая доля добавленного рибофлавина, мкг;

m – масса пробы для испытания, г;

V – общий объем гидролизата, см³;

V₁ – объем гидролизата после окисления, см³:

V₂ – объем гидролизата, используемый для очистки от примесей, см³;

V₃ –объем гидролизата, используемый для облучения см³;

10 – коэффициент пересчета из мкг/г в мг на 100 г продукта:

400 – коэффициент, включающий постоянные величины: m=10 г; V= 250 см ³; V₂= 100 см ³; V₃=20 см³ и коэффициент пересчета = 10.

Вычисления проводят с точностью до третьего десятичного знака с последующим округлением до второго десятичного знака. Полученный результат должен быть в диапазоне 0, 10…0, 60 мг/100 г продукта. В противном случае испытание повторяют с уточненной навеской продукта (см. пункт – гидролиз).

Работа 1.1.4.2. Определение витамина PP в обогащенных хлебобулочных изделиях

Задание: Определение витамина РР в хлебобулочных изделиях. На основании полученных данных, сделать вывод о рекомендуемых дозировках витамина PP.

Теоретическое введение: Определение витамина РР в хлебобулочных изделиях проводят по ГОСТ 29140-91 «Мука. Хлеб и хлебобулочные изделия пшеничные витаминизированные. Метод определения витамина РР (никотиновой кислоты)». Сущность метода определения витамина PP в хлебобулочном изделии заключается восвобождение связанных форм никотиновой кислоты гидролизом, очистка полученного гидролизата, количественное получение окрашенного производного глутаконового альдегида и колориметрическое определение его массы в сравнении со стандартным раствором.

Реактивы и материалы:	никотиновая кислота, раствор серной кислоты концентрации 2, 5 моль/дм3, бром, раствор роданистого калия или роданистого аммония концентраций 0, 1 г/см3 и 0, 01 г/см3, углекислый кальций, метол, раствор соляной кислоты концентрации 0, 5 моль/дм3, активный уголь, этиловый спирт, оксид кальция, известковое молочко, фенолфталеин, раствор сернокислого цинка концентрации 0, 8 г/см3.
Химическая посуда и оборудование:	мерные колбы вместимостью 100 см3 и 500 см3, склянка из темного стекла с притертой пробкой, химический стакан, термометр, колба вместимостью на 100 см3, пипетка, ледяная баня, воронка Бюхнера, фарфоровый стакан вместимостью 2000 см3, плитка, стеклянная палочка, 8 пробирок, спектрофотометр.