Определение глютатиона

 

Цель работы: освоение метода определения глютатиона в растительном и животном сырье.

 

Оборудование, реактивы и материалы: центрифуга, бюретки, пипетки градуированные вместимостью 5 см³, пипетки мерные 10 см³, конические колбы Эрленмейера вместимостью 50 см³, фарфоровые ступки, мерные колбы вместимостью 100 см³, бумажные фильтры, капельницы; раствор сульфосалициловой кислоты с массовой долей 4 %, раствор сульфосалициловой кислоты концентрацией 1 моль/дм³, раствор йодида калия с массовой долей 5 % (раствор готовят непосредственно в день определения и проверяют на отсутствие свободного йода при помощи качественной реакции на крахмал), раствор крахмала с массовой долей 2 %, раствор йодата калия концентрацией 0, 001 моль/дм³; хлебопекарные дрожжи, солод, мясо.

 

Теоретические сведения

 

Глютатион – это трипептид, состоит из остатков аминокислот, глицина, цистеина, глютаминовой кислоты.

Он обнаружен в клетках живых организмов как свободное соединение, содержится в мышечной ткани, зародыше пшеничного зерна, дрожжах, плесневых грибах. Благодаря присутствию реакционно-способной сульфгидрильной группы является переносчиком водорода в окислительно-восстановительных реакциях. Особенно значительна его роль в разложении перекисных соединений, образующихся в процессе метаболизма клетки, ядовитых для живого организма. Восстановленная форма глютатиона повышает активность некоторых протеаз, гидролизующих белок.

Окислительно-восстановительная реакция глютатиона имеет следующий вид:

 

 

 

 

восстановленная окисленная дисульфидная

сульфгидрильная форма глютатиона

форма глютатиона

 

Способность глютатиона легко окисляться лежит в основе его количественного определения. Для окисления восстановленного глютатиона используют йод, образующийся в процессе реакции

KJO₃ + 5 KJ + 3 H₂SO₄ = 2 KSO₄ + 3 H₂O + 6 J.

 

Выделяющийся йод окисляет восстановленный глютатион:

 

2 Гл - SH + J₂ = Гл - S - S - Гл + 2 HJ.

 

Как только весь глютатион перейдет в окисленную форму, избыток йода, взаимодействуя с крахмалом, придает раствору устойчивую синюю окраску. По количеству йодата калия, пошедшего на титрование, определяют количество восстановленного глютатиона.

 

Ход работы

 

Навеску дрожжей массой 10 г или сырого мяса 3 г измельчают в ступке с хорошо промытым и прокаленным кварцевым песком. Полученный гомогенат переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и экстрагируют глютатион двойным объемом воды, встряхивая в течение 10 мин. Затем медленно, при постоянном перемешивании, добавляют 5 см³ раствора сульфосалициловой кислоты концентрацией 1 моль/дм³, содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой. Смесь интенсивно перемешивают и отделяют экстракт глютатиона фильтрованием через сухой обеззоленный фильтр или центрифугированием.

В колбу вместимостью 50 см³ наливают 10 см³ экстракта, добавляют по 2, 5 см³ раствора сульфосалициловой кислоты с массовой долей 4 % и раствора йодида калия вносят 10 капель раствора крахмала. Затем титруют из бюретки раствором йодата калия до появления устойчивой синей окраски, не исчезающей в течение 30 с.

Для проведения контрольного опыта в колбу Эрленмейера вместимостью 50 см³ наливают 10 см³ дистиллированной воды, по 2, 5 см³ раствора сульфосалициловой кислоты с массовой долей 4 % и раствора йодида калия, добавляют 10 капель раствора крахмала и титруют раствором йодата калия до появления устойчивой синей окраски, не исчезающей в течение 30 с. Количество восстановленного глютатиона рассчитывают по формуле

х₁ = (а – б) × 0, 307 × 100,

 

где x₁ – массовая доля восстановленного глютатиона в исследуемом продукте, мг%;

a – объем раствора (йодата калия, израсходованного на титрование рабочего опыта), см³;

б – объем раствора йодата калия, израсходованного на титрование контрольного опыта, см³;

0, 307 – коэффициент, определяющий количество восстановленного глютатиона, соответствующее 1 см³ раствора йодата калия с концентрацией 0, 001 моль/дм³, мг/см³;

100 - коэффициент пересчета на 100 г вещества, %.

 

Оформление результатов

Результаты исследований вносят в таблицу.

 

Наименование объекта исследований	Массовая доля, глютатиона, мг%
Дрожжи Солод Мясо

 

Контрольные вопросы и задания

1. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: глютатион - это трипептид, состоящий из: а) аспарагиновой кислоты, валина и изолейцина, б) глютаминовой кислоты, глицина и серина, в) глицина, аспарагиновой кислоты и цистеина, г) глицина, глютаминовой кислоты и цистеина.

2. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: биологическая активность глютатиона объясняется присутствием в его молекуле: а) карбоксильных групп глютаминовой кислоты, б) сульфгидрильных групп цистеина, в) аминогруппы глицина, г) аминогруппы глютаминовой кислоты.

3. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: какие ферменты активируют восстановленный глютатион: а) амилазы, б) липазы, в) протеазы, г) фосфотазы.

4. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: при определении глютатиона используются следующие реактивы: а) сульфосалициловая кислота, йодат калия, йодит калия, крахмал; б) сульфосалициловая кислота, йодит калия, крахмал; в) сульфосалициловая кислота, глицин, йодат калия, йодит калия; г) крахмал, йодат калия, йодит калия, цистеин.

5. Какая окраска наблюдается при титровании раствора глютатиона йодатом калия?

6. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: какие реагенты формируют синюю окраску при титровании раствора глютатиона йодатом калия: а) глютатион и йод, б) глютатион и йодат калия, в) йод и крахмал, г) крахмал и йодат калия.

7. Определить количество глютатиона в вытяжке дрожжей, если известно, что на титрование опытной и контрольной пробы израсходовано 1, 5 и 0, 1 см³ йодата калия с концентрацией 0, 001 моль/дм³ соответственно.

 

Лабораторная работа № 9