Ход работы. Выделение белков высаливанием

 

Выделение белков высаливанием. Высаливание - процесс выделения белка из раствора при добавлении нейтральных солей. При этом происходит изменение агрегатного состояния белка, связанное с разрушением гидратной оболочки молекул при полном сохранении нативных свойств. Высаливание широко используется при разделении и получении в очищенном виде белков и ферментов. Характер растворимости белка является его специфическим свойством, поэтому особое значение высаливание имеет при фракционировании и классификации белков.

К 2-3 см³ раствора белка добавляют 2 см³ насыщенного раствора сульфата аммония или хлорида натрия. Смесь встряхивают и фиксируют появляющийся осадок глобулиновой фракции. Мутную жидкость фильтруют через сухой складчатый фильтр. Нa кончике шпателя вносят дополнительно сухую соль до появления осадка альбуминовой фракции белка.

Обратимость процесса высаливания проверяют внесением в пробу альбуминной фракции избытка дистиллированной воды, в глобулиновую фракцию добавляют избыток слабосолевых растворов.

Процесс высаливания сульфатом аммония возможен в слабокислой или нейтральной среде, при добавлении хлорида натрия раствор белка необходимо предварительно подкислить.

Осаждение белков органическими растворителями. Смешивающиеся с водой растворители (этанол, ацетон) снижают диэлектрическую постоянную белковых растворов. Вследствие этого уменьшается ионизация белков, между белковыми частицами усиливается притяжение, способствующее их агрегации и снижению растворимости.

Кратковременное действие органических растворителей при пониженных температурах вызывает обратимое осаждение, длительное действие может быть причиной денатурации белков. Внесение белков в органические растворители при отрицательных значениях температуры используется для изучения быстро протекающих биохимических реакций.

К 1 см³ белкового раствора добавляют 1, 5-2, 0 см³ раствора этанола или раствора ацетона. Пробирку встряхивают и фиксируют выпадение осадка.

Обратимость явления проверяют добавлением избытка дистиллированной воды.

Денатурация белков при нагревании. Белки (кроме желатина) подвергаются структурным изменениям и выпадают в осадок при нагревании их растворов до 50-60 °С. При этом они необратимо утрачивают свои специфические свойства (способность к растворению в воде, солевых и спиртовых растворах; биологическую активность). Нередко это явление используют для распознавания белков в растворах. Термическая денатурация широко применяется для доведения продуктов до кулинарной готовности, а также повышения усвояемости белковой пищи организмом.

В пробирку наливают 1-3 см³ белкового раствора и постепенно нагревают, доводя до кипения. Фиксируют образование белкового коагулянта. Необратимость процесса проверяют добавляя избыток дистиллированной воды.

Осаждение белков в среде концентрированных минеральных кислот. Концентрированные минеральные кислоты вызывают необратимое осаждение белков. Действие этих реагентов состоит в глубоком денатурировании белковой молекулы, связанное как с процессом дегидратации белковых глобул, так и химическим взаимодействием с функциональными группами.

В три сухие пробирки отдельно наливают по 1-2 см³ концентрированных азотной, серной и соляной кислот, затем осторожно (под тягой) прибавляют в каждую пробирку по 1 см³ раствора белка так, чтобы не смешивать жидкости. На границе раздела образуется белое кольцо выпавшего в осадок белка. При встряхивании осадок, выпавший в пробирке с азотной кислотой, увеличивается, в двух остальных пробирках при действии избытка соляной и серной кислот осадки растворяются. При действии концентрированных минеральных кислот на раствор желатина осадок не выделяется.

Осаждение белков солями тяжелых металлов. Соли тяжелых металлов (Hg, Ag, Cu, Pb) образуют с белками нерастворимые в воде соединения. Использование для осаждения солей меди вызывает образование хлопьевидного осадка голубого цвета, при использовании солей свинца цвет осадка белый. При избытке осадителя его ионы адсорбируются на поверхности белковой молекулы, которая вследствие этого приобретает заряд, что приводит к растворению осадка.

В две пробирки наливает по 1-2 см³ раствора белка и медленно по каплям добавляют при постоянном перемешивании в одну из них раствор сульфата меди, а в другую – раствор ацетата свинца. Наблюдают образование осадка и отмечают его цвет.

 

Оформление результатов

 

Полученные экспериментальные данные вносят в таблицу.

 

Наименование показателей	Белок куриного яйца	Яичный альбумин	Растительный белок	Казеин молока
Выделение белков высаливанием Осаждение белков органическими растворителями Денатурация белков при нагревании Осаждение белков в среде концентрированных минеральных кислот Осаждение белков солями тяжелых металлов

 

В конце работы делают вывод о свойствах исследуемых белков.

 

Контрольные вопросы и задания

1. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: какой реагент можно использовать в процессе высаливания белков: а) ацетон, б) хлорид натрия, в) концентрированную соляную кислоту, г) концентрированный гидроксид натрия.

2. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: высаливание белков является процессом: а) необратимым, б) частично обратимым, в) обратимым, г) обратимым только в присутствии соляной кислоты.

3. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: под действием какого реагента можно вызвать частично обратимое выпадение белков в осадок: а) нейтральных солей, б) органических растворителей, в) концентрированных оснований, г) концентрированных кислот.

4. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: под действием каких из перечисленных факторов возможна денатурация белковой молекулы: а) температуры 100 °С, б) при добавлении в раствор хлорида натрия, в) при добавлении в раствор гидроксида аммония, г) при понижении температуры до 10 °С.

5. С какой целью проводят высаливание белков?

 

Лабораторная работа № 6