Ход работы. Биуретовая реакция. Она обусловлена наличием в молекуле белка пептидных связей (-CO-NH-) и используется в количественных колориметрических определениях белка

 

Биуретовая реакция. Она обусловлена наличием в молекуле белка пептидных связей (-CO-NH-) и используется в количественных колориметрических определениях белка. B щелочной среде пептидные группы в молекуле белка переходят в энольную форму:

	NH2

NH2

 

Полипептид в энольной форме взаимодействует с гидроксидом меди и образует комплексное соединение, в котором координационные связи образованы за счет электронных пар атомов азота. Окраска такого комплекса фиолетовая. Аналогично образуется комплексное соединение с энолизированными пептидными группами глютатиона; образующийся при этом комплекс имеет красно-фиолетовый цвет:

 

 

,

 

 

где R₁, R₂, R₃, R₄ - остатки аминокислот в полипептидной цепи белка.

В пробирку вместимостью 10 см³ вносят 0, 5 см³ (5-6 капель) раствора исследуемого белка, добавляют 1 см³ раствора гидроксида натрия, 0, 2-0, 3 см³ раствора сульфата меди. После перемешивания фиксируют изменение цвета, свидетельствующее о наличии пептидных связей в молекуле белка.

тирозин

фенилаланин

триптофан

Ксантопротеиновая реакция (реакция Мульдера). Она обусловлена образованием нитросоединений ароматическими и некоторыми гетероциклическими группами белка, указывает на присутствие в молекуле полипептида ароматических аминокислот:

 

Реакция идет по следующей схеме:

 

 

После образования нормального нитросоединения под действием концентрированной азотной кислоты, при добавлении к охлажденной жидкости избытка аммиака или едкой щелочи желтая окраска нитросоединений переходит в оранжевую за счет образования солей нитроновых кислот. Нитроновые кислоты являются кислотной формой жирных или жирноароматических первичных и вторичных нитросоединений и находятся в таутомерном равновесии с соответствующими нормальными нитро-соединениями:

нормальные нитросоединения

кислотная форма нитросоединений

 

В пробирку вносят 2-3 капли раствора белка и постепенно добавляют по каплям концентрированную азотную кислоту до тех пор, пока не прекратится образование осадка, затем нагревают. В присутствии аминокислот (тирозина, триптофана, фенил-аланина) осадок окрашивается в желтый цвет c последующим растворением. Пробирку с жидкостью охлаждают и добавляют 1 см³ гидроксида натрия. Цвет раствора становится оранжевым.

Реакция Миллона. Она является качественной реакцией на белки, содержащие фенольный радикал, протекает в присутствии реактива Милона:

 

В пробирку наливают 1 см³ белкового раствора и прибавляют 2 см³ азотнортутного реактива Миллона, при этом наблюдают образование белого осадка денатурированного белка. Затем осторожно нагревают (не выше 50 °С). Цвет осадка денатурированного белка, содержащего тирозин, переходит в розово-красный. Белки, содержащие триптофан, приобретают буро-красный цвет.

Нингидриновая реакция. Она осуществляется при одновременном участии a-аминной и карбоксильной групп, что позволяет идентифицировать свободные аминокислоты в растворах. Большинство аминокислот дает голубую или лиловую окраску, аспарагин - оранжево-коричневую, пролин и оксипролин – желтую:

 

a-аминокислота нингидрин восстановленный

нингидрин

восстановленный нингидрин

нингидрин

	продукт конденсации

 

В данной реакции кислород из нингидрина окисляет a–аминокислоту. Для получения щелочной реакции среды к 1 см³ раствора белка добавляют 0, 5 см³ раствора гидроксида натрия и 2-3 капли свежеприготовленного раствора нингидрина, нагревают до кипения и 1-2 мин кипятят. Фиксируют изменение цвета.

Реакция с уксуснокислым свинцом. Она указывает на присутствие в белковой молекуле цистеина и цистина, содержащих атомы серы и протекает по схеме:

 

 

цистеин серин

 

Na₂S+Na₂PbO₂+2H₂О ® PbS¯ +4 NaOH

 

В результате реакции выпадает черный осадок сульфата свинца. Интенсивность окраски зависит от концентрации белка в растворе и количества в белке аминокислот цистеина и цистина.

В пробирки вносят по 1 см³ белковых растворов и добавляют двойной объем раствора гидроксида натрия, перемешивают, кипятят 2-3 мин и наливают 0, 1-0, 2 см³ раствора свинца, нагревание продолжают до появления черного осадка.

Исследование белков на содержание в структуре фосфора. В настоящее время белки подразделяются на два больших класса: простые и сложные. Простые белки состоят только из аминокислот, а сложные, кроме того, содержат небелковые компоненты различной природы.

Казеин (белок молока), например, является типичным фосфопротеидом. При щелочном гидролизе он распадается на белковый компонент и фосфорную кислоту, которую можно обнаружить специфической реакцией с молибденовым реактивом по схеме:

 

 

12(NH₄)₂MoO₄ + H₃PO₄ + 21HNO₃ ® 21NH₄NO₃ + (NH₄)₃PO₄ × 12MoO₃ + 12H₂O.

 

В большую термостойкую пробирку вносят 100 мг казеина, приливают 4 см³ раствора гидроксида натрия, закрывают пробирку пробкой со стеклянной трубкой в качестве, воздушного холодильника и ставят в водяную баню при температуре кипения (100±5 °С) на 1 час, затем пробирку охлаждают, нейтрализуют добавлением 12-15 капель концентрированной азотной кислоты до слабокислой реакции на лакмус. Выпадает осадок продуктов неполного гидролиза белка, который отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр.

К 1 см³ молибденового реактива добавляют 1 см³ полученного гидролизата казеина и кипятят на пламени горелки. Фиксируют наличие лимонно-желтого цвета в пробирке, а после охлаждения смеси под струей холодной воды – выпадение желтого кристаллического осадка комплексного соединения фосфорномолибденовокислого аммония.

Для сравнения аналогичные операции проводят и с другими белками.

Оформление результатов

Все полученные экспериментальные данные вносят в таблицу. В ней указывают название растительного белка. Наличие аминокислот в белковой молекуле отмечают знаками (+) или (–).

 

Качественные реакции	Наименование белков
Казеин	Яичный альбумин	Белки мяса	Желатин	Растительный белок
Биуретовая Ксантопротеиновая Миллона С уксуснокислым свинцом На присутствие фосфора

 

Контрольные вопросы и задания

1. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: с помощью биуретовой реакции можно установить присутствие в белковой молекуле: а) циклических аминокислот, б) серосодержащих аминокислот, в) свободных a-аминокислот, г) пептидных связей.

2. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: какую окраску имеет раствор белка после добавления гидроксида натрия и сульфата меди: а) желтую, б) черную, в) фиолетовую, г) сиреневую.

3. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: ксантопротеиновая реакция позволяет установить присутствие в белковой молекуле: а) циклических аминокислот, б) серосодержащих аминокислот, в) пептидных связей, г) свободных a-аминокислот.

4. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: при проведении ксантопротеиновой реакции с яичным альбумином раствор приобретает цвет: а) фиолетовый, б) желтый, переходящий в оранжевый, в) сиреневый, г) кирпично-красный.

5. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: реакция Миллона позволяет установить присутствие в белковой молекуле: а) серосодержащих аминокислот, б) глицина, в) пептидных связей, г) тирозина.

6. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: при проведении реакции Миллона с яичным альбумином раствор приобретает цвет: а) кирпично-красный, б) фиолетовый, в) черный, г) сиреневый.

7. Из предложенных вариантов выберете правильный ответ: реакция с ацетатом свинца позволяет установить присутствие в белковой молекуле: а) тирозина, б) серосодержащих аминокислот, в) циклических аминокислот, г) пептидных связей.

8. При добавлении к раствору яичного альбумина нингидрина цвет жидкости становится: а) розово-сиреневой, б) желтой, в) черной, г) кирпично-красной.

9. Рассчитать массовую долю кислорода, содержащегося в молекуле тирозина.

10. Рассчитать массовую долю серы, содержащейся в молекуле цистеина.

11. С какой целью проводятся цветные реакции на белки?

12. Почему метионин не дет качественную реакцию с уксуснокислым свинцом?

 

Лабораторная работа № 2