Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминисцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминисцирующей сывороткой светятся в виде каймы зеленого цвета. Данный метод является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или антител.
Иммуноферментный метод (ИФА). Принцип метода следующий: на твердофазном носителе (поверхность лунок полистиролового планшета) фиксируется АГ возбудителя инфекции, антитела к которому необходимо выявить. Антиген, иммобилизованный на поверхности твердого носителя, называют иммуносорбентом. В ходе инкубации иммуносорбента с испытуемой сывороткой при наличие в ней АТ к данному АГ происходит их связывание в комплекс «антиген-антитело». Затем следует инкубация с меченными ферментом антителами к иммуноглобулинам человека (конъюгатом), в ходе которой на поверхности носителя происходит присоединение к комплексу антител, меченых ферментом (в качестве фермента чаще всего используется пероксидаза хрена). Конъюгат получают на основе поликлональных антивидовых АТ, например кроличьи АТ или моноклональных АТ, направленных против человеческих иммуноглобулинов определенного класса M, G, A. В дальнейшем при добавлении субстрата происходит его взаимодействие с ферментом, в результате чего развивается цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных АТ. При использовании пероксидазного конъюгата в качестве субстрата применяют перекись водорода в сочетании с ортофенилдиамином. Результаты реакции оцениваются спектрофотометрически с выводом цифровых данных, что исключает субъективность оценки антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В, цитомегаловирусной инфекции, герпесной, токсоплазменной, а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ.
Иммунный блоттинг. В России в настоящее время стандартной процедурой лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к ВИЧ с последующим подтверждением их специфичности в реакции иммунного блоттинга. Обнаружение антител к ВИЧ включает два этапа. На первом этапе проводится выявление суммарного спектра антител (ИФА), на втором этапе методом иммунного блоттинга проводится определение антител к отдельным белкам вируса, иммобилизованным на нитроцеллюлозную мембрану. Белки оболочки вируса ВИЧ1, обозначаемые как гликопротеины («gp» джи пи)с молекулярным весом, выраженным в килодальтонах: 160кд, 120кд, 41кд. У ВИЧ2 гликопротеины имеют вес 140 кд, 105кд, 36кд. Белки сердцевины (gag), обозначаемые как протеины («p» пи) у ВИЧ1 имеют молекулярный вес соответственно 55кд, 24кд, 17кд, а ВИЧ2 – 56кд, 26кд, 18кд. Результаты интерпретируются как положительные, в которых обнаруживаются антитела к 2 или 3 гликопротеинам ВИЧ. Отрицательными считаются сыворотки, в которых не обнаруживается антител ни к одному из белков.
