Определение активности интерферона
1. Взвесь диплоидных фибробластов плода человека на среде с 10% сывороткой эмбрионов коров (концентрация клеток - 15-20× 106/мл) разливают в стерильные 96-луночные плоскодонные планшеты по 100 мкл в лунку и помещают в СО2-инкубатор при температуре 37 °С. 2. После формирования полного монослоя из лунок удаляют ростовую среду и в каждую лунку добавляют по 100 мкл поддерживающей среды. 3. Титрование активности ИФН в исследуемых образцах проводят методом двукратных разведений на монослое фибробластов. Одновременно с образцами в лунки вносят вирус энцефаломиелита мышей (ВЭМ) в дозе, вызывающей 100% поражение клеток через 48 ч после заражения. 4. Для контроля используют лунки с интактными (необработанными) клетками, зараженными вирусом. В каждом исследовании в качестве референс-препаратов используют пробы референс-ИФН с известной активностью. 5. Планшеты с разведениями образца инкубируют 24 ч при температуре 37 °С в атмосфере с 5% содержанием СО2. 6. Уровень активности ИФН определяют величиной, обратной значению максимального разведения тестируемого образца, задерживающего цитопатическое действие вируса на 50%, и выражают ее в единицах активности на 1 мл. 7. Для определения типа ИФН в систему добавляют антисыворотку против ИФНα, ИФНβ или ИФНγ. Антисыворотка отменяет действие соответствующего цитокина, что позволяет идентифицировать тип ИФН. Определение биологической активности миграции ингибирующего фактора. В настоящее время сформировались совершенно новые представления о природе и свойствах МИФ, открытого в 60-х годах прошлого столетия в качестве медиатора клеточного иммунитета и много лет остававшегося без должного внимания (Bloom B.R., Bennet В., 1966; David J.R., 1966). Лишь в последние 10-15 лет стало ясно: МИФ представляет собой один из важнейших биологических медиаторов в организме с широким спектром биологических функций цитокина, гормона, фермента. Действие МИФ на клетки-мишени реализуется через СD74--рецептор или через неклассический путь эндоцитоза. МИФ рассматривают как важный медиатор воспаления, активирующий функцию макрофагов (выработку цитокинов, фагоцитоз, цитотоксичность и др.), а также как эндогенный иммунорегуляторный гормон, модулирующий глюкокортикоидную активность. Накапливается все больше сведений о роли МИФ в патогенезе многих воспалительных заболеваний, включая сепсис, ревматоидный артрит (РА), гломерулонефрит и др. При РА значительно увеличена концентрация МИФ в жидкости пораженных суставов, коррелирующая с тяжестью заболевания. Под влиянием МИФ возрастает выработка провоспалительных цитокинов как макрофагами, так и синовиальными клетками. Известны различные методы тестирования активности МИФ, когда мигрирующие клетки (клетки-мишени для МИФ) помещают в стеклянный капилляр (капиллярный тест), в каплю агарозы или в агарозный колодец. Мы приводим сравнительно простой скрининговый метод, основанный на формировании на дне лунок 96-луночного плоскодонного планшета клеточных микрокультур (лейкоцитов или макрофагов), стандартных по площади и числу клеток, с последующим их культивированием в питательной среде и определением изменения площади этих микрокультур при действии МИФ (Суслов А.П., 1989).
|
