Задание 3. Изучение различных морфологических групп микроорганизмов

Изучить с иммерсионным объективом и зарисовать фиксированный мазок навозного настоя, окрашенный по Романовскому-Гимзе или готовые фиксированные препараты стафилококков, тетракокков, монококков, сарцин, клостридий, бацилл.

Контрольные ВОПРОСЫ

1. Дайте понятие культуры микроорганизмов, перечислите виды лабораторных культур микроорганизмов.

2. Перечислите методы микроскопического исследования микроорганизмов, приведите положительные и отрицательные стороны каждого метода.

3. Какие препараты можно приготовить для наблюдения живых клеток?

4. Какие красители можно использовать при приготовлении прижизненных препаратов микроорганизмов?

5. С какой целью применяется фиксация при приготовлении препаратов микроорганизмов?

6. Для чего при изучении фиксированных препаратов микроорганизмов используют иммерсионное масло?

7. На какие группы делят бактерии по форме клеток?

8. Какие группировки могут образовывать шаровидные бактерии?

9. Перечислите типы извитых бактерий, приведите их отличия.

1.2. Тинкториальные свойства микроорганизмов. Методы окраски.
Ультраструктура бактерий

Цель занятия

Познакомиться с простыми и дифференцированными методами окрашивания препаратов микроорганизмов, освоить методику выявления клеточных структур микроорганизмов.

Основные сведения

Морфологические особенности клеток микроорганизмов можно изучать, используя различные методы микроскопии, а также применяя некоторые способы дифференциальной окраски. Тинкториальными свойствами называют способность клеток микроорганизмов воспринимать различные красители.

Красители, методы окраски препаратов микроорганизмов

Клетки микроорганизмов окрашивают, главным образом, анилиновыми красителями. Различают кислые и основные красители в зависимости от того, где в молекуле красителя стоит хромофорная (красящая группа). Если она находится при анионе – краска является кислой (например, индиго-кармин, эозин, эритрозин), если при катионе – основной (нейтральный красный, метиленовый синий, генциановый фиолетовый). Бактериальные клетки лучше всего окрашиваются основными красителями, так как они интенсивнее связываются с ядерными компонентами клеток (высокая концентрация ДНК и рибосомальной РНК в клетке бактерий делает её более чувствительной к основным красителям)..

Различают простые и дифференциальные (сложные) способы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка. Дифференциальная окраска предполагает окрашивание определенных структур клетки (или запасных питательных веществ) а также дифференциацию микроорганизмов по особенности строения клеточной стенки (окрашивание по методам Грама и Циля-Нильсена) или ядерного материала (окрашивание по методу Романовского-Гимзе).

Для простого окрашивания клеток микроорганизмов фиксированные мазки помещают над стеклянной кюветой и заливают раствором красителя на 1–3 минуты. При подсыхании мазка подливают новые порции красителей. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо растворов красителей фильтровальную бумагу, заранее пропитанную красителем. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганизмов.

Для люминесцентной микроскопии фиксированные или нативные препараты микроорганизмов окрашивают специальными флюоресцентными красителями: акридиновым желтым, акридиновым оранжевым, ауромином, корифосфином.

Наиболее часто используемые красители

Метиленовый синий. Основной краситель, окрашивает клетки в зависимости от концентрации в синий или голубой цвет. Используют для окрашивания фиксированных мазков (водные растворы в концентрации 1: 40 от насыщенного спиртового раствора) и прижизненных препаратов (водные растворы в концентрации 1: 1000 от насыщенного спиртового раствора). Насыщенный спиртовый раствор готовят на 96 % этаноле из расчета 3 г порошка метиленового синего на 100 мл этанола.

Фуксин. Основной краситель, окрашивает клетки в красный цвет. Используют для окрашивания фиксированных мазков (водные растворы в концентрации 1: 10 от насыщенного спиртового раствора) и прижизненных препаратов (водные растворы в концентрации 1: 100 от насыщенного спиртового раствора. Насыщенный спиртовый раствор готовят на 90 % этаноле из расчета 10г порошка фуксина на 100мл этанола.

Генциановый фиолетовый. Основной краситель, окрашивает клетки в фиолетовый цвет. Используют для окрашивания фиксированных мазков (водные растворы в концентрации 1: 10 от насыщенного спиртового раствора). Насыщенный спиртовый раствор готовят на 96 % этаноле из расчета 10г порошка генцианового фиолетового на 100мл этанола. Точно так же готовятся растворы кристаллического фиолетового. Для окрашивания препаратов по методу Грама и окрашивания спор готовят растворы красителей на карболовой кислоте (карболовый фуксин Циля и карболовый раствор генцианового фиолетового)

Судан III. Используют для окрашивания жировых включений в бактериальных клетках. Готовят 0, 5 % раствор на 96 % этаноле или концентрированной молочной кислоте.

Черная тушь. Раствор туши (5мл туши и 15 мл дистиллированной воды, смешать и дать отстояться 2 недели, использовать надосадочную жидкость) используют для негативной окраски капсул микроорганизмов.

Раствор Люголя. Используют для окрашивания фиксированных мазков по методу Грама (кристаллический йод – 1 г иодид калия – 2 г, дистиллированная вода 300 мл) и для выявления включений гликогена и гранулёзы (кристаллический йод – 7 г, иодид калия – 20 г, дистиллированная вода 300 мл)

Эритрозин. Используют для окрашивания почвенных бактерий. Краситель хорошо окрашивает бактериальные клетки и не окрашивает почвенные частицы. Готовят 1–5 % карболовый раствор красителя (на 100 мл дистиллированной воды 5 г фенола и 1–5 г эритрозина).

Внутриклеточные включения

Многие микроорганизмы в определенных условиях образуют запасные вещества, которые обнаруживаются в клетке в виде гранулярных цитоплазматических включений. Природа запасных веществ различна, чаще всего это полисахариды, липиды, полифосфаты.

Гранулы углеводной природы (полисахариды) выявляют при обработке клеток раствором Люголя. Гранулы гранулёзы окрашиваются в синий, гликогеноподобных полисахаридов – в красновато-коричневый цвет.

Липидные включения у дрожжей и мицелиальных грибов представлены нейтральными жирами, которые легко обнаруживаются в живых клетках без специальных методов окрашивания в виде сильно преломляющих свет капель. Бактерии в качестве резервных липидов образуют поли-b-оксимасляную кислоту, гранулы которой выявляют Суданом III (красно-оранжевое окрашивание).

Полифосфаты (волютин, метахроматин) в клетках прокариот локализованы в цитоплазме, в клетках эукариот – в вакуолях. Окраска волютиновых зёрен основана на свойстве метахромазии – способности вызывать изменение цвета некоторых красителей (метиленовый синий). Волютин легко выявить окраской по способу Омелянского, основанному на плохой растворимости волютина в растворах кислот. При правильном окрашивании гранулы волютина имеют красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы.

Клеточные структуры

Капсулы. Клетки многих микроорганизмов, особенно при росте их на средах, богатых углеводами, могут быть окружены рыхлым внешним слоем – слизистой капсулой или чехлом. Химический состав капсул у разных бактерий неодинаков, поэтому их нельзя выявить каким-либо одним методом окраски. Поэтому чаще всего для выявления капсул применяют способ «негативной» окраски (негативного контрастирования) при помощи жидкой туши.

Эндоспоры образуют бактерии родов Bacillus, Clostridium и некоторых других. Споры можно обнаружить путём дифференциального окрашивания цитоплазмы и споры. Споры, имеющие многослойную и труднопроницаемую оболочку, окрашиваются только при нагревании или после протравливания раствором кислот.

Клеточная стенка. С молекулярной организацией и химическим составом клеточной стенки связывают способность бактерий окрашиваться по Граму. Эта окраска является важным диагностическим признаком, она коррелирует со многими другими свойствами бактерий. По способности окрашиваться красителями триметилфенолового ряда все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные. Грамположительные бактерии удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом при обработке препарата спиртом и поэтому окрашиваются в фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают такой способностью и обесцвечиваются спиртом. При последующей обработке фуксином они приобретают красную окраску.

Кислотоустойчивость – свойство, характерное для некоторых микобактерий и нокардий. Это способность клеток сохранять окраску при последующей обработки их раствором минеральных кислот. Кислотоустойчивость обусловлена особенностями химического состава клеточных стенок, высоким содержанием сложных липидов, в частности, наличием миколовых кислот. Кислоты соединяются сложноэфирной связью с углеводом клеточной стенки, придавая оболочке гидрофобный характер. Для выявления кислотоустойчивости бактерий применяют окраску по методу Циля-Нильсена.

Жгутики обуславливают способность микроорганизмов к движению. Способность микроорганизмов к движению выявляют в препаратах «висячая капля» или «раздавленная капля». Подвижность клеток следует отличать от их пассивного перемещения в результате броуновского движения, которое особенно заметно в суспензиях с большой плотностью (для различения к капле исследуемой культуры добавляют каплю 0, 5%-го водного раствора фенола, активное движение тотчас прекращается, а броуновское продолжается). Подвижность определяют у клеток молодой, чаще всего суточной культуры, поскольку с возрастом клетки могут ее терять. Расположение и количество жгутиков в ряде случаев имеет диагностическое значение. Отдельный жгутик настолько тонок, что не неразличим в световой микроскоп без окрашивания, увеличивающего его толщину. Все способы окрашивания жгутиков (Леффлера в модификации Пешкова, Фонтана) основаны на использовании протрав, осаждающихся на их поверхности и увеличивающих их диаметр.

Содержание лабораторной работы