Задание 1. Освоение техники посева материала и получение чистых культур микроорганизмов

а) для получения смывов с кожи рук и выделение чистой культуры представителей микрофлоры кожи используют стерильные ватные тампоны, находящиеся в стерильной пробирке с 5 мл стерильной воды. Перед взятием смыва увлажняют тампон, вынимают из пробирки с помощью стерильного пинцета, дают в руки обследуемому и он протирает сначала кожу левой, затем правой руки в следующей последовательности: тыльная сторона кисти, ладонь, межпальцевые пространства, ногтевые ложа. После окончания процедуры тампон помещают обратно в пробирку, тщательно отполаскивают и перемешивают раствор.

Для выделения чистой культуры можно использовать несколько способов посева полученного материала;

- с помощью стерильной петли полученный раствор наносят в несколько (5–7) касаний на внутреннюю сторону крышки чашки Петри. Далее стерильным шпателем смешивают нанесенный материал с конденсатом и втирают полученный раствор в поверхность питательной среды;

- полученный раствор втирают в поверхность среду у края чашки, затем оставшийся на петле материал рассевают параллельными штрихами по поверхности среды.

б) для выделения чистой культуры представителей микрофлоры слизистой глотки полученный ранее и засеянный в питательный бульон материал со слизистой глотки (зева) вносят в чашку Петри со стерильным питательным агаром и выделяют чистую культуру любым из описанных выше методов. Чашки с посевами подписывают по боковой стороне, переворачивают вверх дном и термостатируют при 37º С в течение 1–2 суток.

Контрольные ВОПРОСЫ

1. Дайте определение понятиям «чистая культура микроорганизмов» и «накопительная культура микроорганизмов».

2. Какие методы используют для выделения чистой культуры микроорганизмов?

3. Каким способом можно проверить чистоту выделенной культуры микроорганизмов?

4. Как сохраняют чистые культуры в лабораториях?

5. Что такое лиофилизация?

6. Какие инструменты используют при посевах и пересевах культур микроорганизмов?

7. Как пересеять культуру с помощью шпателя?

8. В каких случаях используют микробиологические иглы?

2.3. Методы стерилизации, дезинфекции и антисептики. Влияние
на микроорганизмы физико-химических факторов

Цель занятия

Познакомиться с методами стерилизации посуды, оборудования и питательных сред; методами и средствами дезинфекции, асептики и антисептики.

Основные сведения

Методы стерилизации

Стерилизация (обеспложивание) – комплекс методов, используемых для уничтожения всех форм жизни как на поверхности, так и внутри стерилизуемых объектов. В микробиологической лаборатории стерилизуют питательные среды, посуду, инструменты и другие необходимые предметы с целью не допустить развития посторонних микроорганизмов в исследуемых культурах. Различают термическую и холодную стерилизацию. В микробиологии используют следующие способы термической стерилизации: прокаливание и обжигание в пламени спиртовки, сухожаровая стерилизация (горячим воздухом), автоклавирование (насыщенным паром под давлением), дробная стерилизация (тиндализация), пастеризация, кипячение. Из методов холодной стерилизации применяют фильтрование через бактериальные фильтры, стерилизацию газообразными средствами, ультрафиолетовыми лучами, ультразвуком. Целесообразность использования того или иного метода определяется физико-химическими свойствами материала, подлежащего стерилизации и целью исследования.

1. Автоклавирование – наиболее надежный и чаще всего применяемый метод стерилизации. Он основан на нагревании материала насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного. При этом погибают и вегетативные клетки микроорганизмов и их споры. Стерилизацию автоклавированием осуществляют в закрывающихся толстостенных аппаратах – автоклавах. Режим автоклавирования выражают в единицах избыточного давления и продолжительности времени. Избыточное давление в 1 атм устанавливается при достижении температуры в камере 121º С, в 1, 5 атм – 125º С, в 2 атм – 134º С. При таких режимах автоклавирования вегетативные формы микроорганизмов погибают в течение нескольких минут, а споры – в течение 20–30 минут. Режим стерилизации выбирают в зависимости от свойств стерилизуемого материала. Так. Питательные среды стерилизуют 20–30 минут при 1 атм, перевязочный материал и резиновые изделия – от 1 до 2 часов при 1–1, 5 атм. Температура и длительность автоклавирования питательных сред определяется их составом и термоустойчивостью компонентов. Так, питательные среды, содержащие молоко, желатин, сахара, витамины, обычно стерилизуют при 0, 5 атм 15–30 мин. Мясопептонные среды можно стерилизовать при 1, 0 атм в течение 20 мин. Среды с агаром требуют вдвое больше времени, чем такой же объем воды. С трудом поддаются стерилизации в автоклаве различные порошки и вязкие жидкости. Так как режим автоклавирования зависит и от объема стерилизуемого субстрата, для выбора оптимального варианта можно использовать справочные таблицы. Для контроля режима стерилизации используют вещества с определенной температурой плавления (бензаурин, бензойная кислота, мочевина, глюкоза). Их смешивают с метиленовым синим, помещают в ампулы и раскладывают в автоклаве перед началом стерилизации. Эти вещества расплавляются в ампуле при достижении соответствующей температуры и окрашиваются в цвет добавляемого красителя.

2. Тиндализация или дробная стерилизация используется для сред, состоящих из термолабильных компонентов. Тиндализацию осуществляют текучим паром в автоклаве с незавинченной крышкой (при атмосферном давлении) или в кипятильнике Коха. Среды прогревают несколько раз по 10–15 мин при температуре около 100º С. Между прогреваниями среды помещают в термостат при температуре 30º С на 8–12 часов для прорастания жизнеспособных спор микроорганизмов. Среды, не выдерживающие нагревания при 100º С, прогревают при 60–80º через каждые 8–12 часов 4–5 дней подряд.

3. Пастеризация – однократный прогрев материала при температуре ниже 100º С. Этот метод предложен Л. Пастером и предназначен для уничтожения только бесспоровых форм микроорганизмов. Пастеризацию проводят при 60–90º С в течение 10–30 мин, используют, главным образом, в пищевой промышленности для обработки молока, фруктовых соков, вина и пива.

4. Сухожаровая стерилизация в основном используется для подготовки стеклянной посуды. Стерилизацию проводят при температуре не выше 180º С в течение 1–3 часов. При этом погибают и вегетативные клетки и споры микроорганизмов. Стерилизацию осуществляют в специальных суховоздушных (сухожаровых) стерилизаторах и сушильных шкафах, приспособленных для стерилизации. Они различаются по форме и способам обогрева, но имеют сходное устройство. Посуду перед стерилизацией тщательно готовят: моют, сушат, заворачивают в бумагу для сохранения стерильности после прогревания (ее развертывают непосредственно перед использованием). В верхние концы пипеток вставляют ватные тампоны, колбы и пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками. Подготовленную посуду равномерно размещают на полках стерилизатора, прогревают и остужают до комнатной температуры, не открывая дверцу во избежание резкого охлаждения.

5. Прокаливанием или обжиганием в пламени спиртовки (горелки) непосредственно перед использованием стерилизуют мелкие металлические инструменты (петли, иглы, пинцеты, ножницы, шпатели). В пламени кратковременно можно стерилизовать предметные и покровные стекла, стеклянные шпатели, палочки, фарфоровые ступки и пестики (лучше в них растереть небольшое количество чистого этанола и дать ему сгореть), горлышки колб и пробирок, ватно-марлевые тампоны. В пламени погибают и вегетативные клетки и споры микроорганизмов.

6. Длительным кипячением в дистиллированной воде (в течение 30-60 мин) иногда стерилизуют металлические инструменты, мелкие стеклянные детали, мембранные фильтры, резиновые трубки, пробки. Для этой цели используют специальные закрытые сосуды – стерилизаторы (или металлическую посуду с крышкой). Мембранные фильтры кипятят в стеклянных колбах, закрытых ватно-марлевой пробкой. Этот метод используют редко, так как длительное кипячение может повредить стерилизуемый материал. Надежность стерилизации может быть увеличена внесением в воду какого-либо бактерицидного средства: 2 % формальдегида, или 1 % бриллиантового зеленого. При 100º С вегетативные формы микроорганизмов и большинство вирусов погибают быстро (в течение нескольких минут).

7. Фильтрованием стерилизуют синтетические среды строго определенного состава, которые содержат легкоразрушающиеся или летучие компоненты (витамины, аминокислоты, белки, ароматические углеводороды, антибиотики). Фильтрование жидкостей осуществляют через мелкопористые материалы, легко адсорбирующие клетки микроорганизмов: асбест, целлюлозу, фарфор, каолин (размер пор не должен превышать 0, 7 мкм). Наиболее широкое распространение получили мембранные фильтры, изготовленные на основе нитроцеллюлозы. Наиболее широко известны фильтрующие пластины фирм «Миллипор», «Синпор», «Владипор». Плотные диски, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой, называются фильтрами Зейтца. Используют также стеклянные пористые фильтры из каолина с примесью кварцевого песка – «свечи» Шамберлана. Их помещают в специальный фильтродержатель и стерилизуют в автоклаве, а затем, смонтировав держатель с колбой, под давлением пропускают стерилизуемый раствор. После стерилизующей фильтрации среды и растворы обязательно проверяют на стерильность, помещая микропробы простерилизованных растворов в термостат при 37º С.

8. Газообразными веществами стерилизуют аппаратуру, имеющую зеркальное, оптическое и радиоэлектронное оборудование, а также изделия из термолабильных пластмасс (центрифужные пробирки и др.). Для газовой стерилизации используют вещества, обладающие спороцидными свойствами: оксид этилена, метилбромид, оксид пропилена, формальдегид, глютаральдегид, β -пропиолактон, озон и др. Особенно эффективна смесь оксида этилена и метилбромида в массовом соотношении 1: 44 (смесь «ОБ»). Газовую стерилизацию проводят в специальных герметически закрывающихся аппаратах. Стерилизуемые объекты упаковывают в материал, пропускающий газ и влагу (оберточную бумагу, муслин, хлорвиниловую или нейлоновую пленку). В большинстве случаев процесс проводят в сочетании с некоторым повышением температуры (до 45–70º С). Оптимальный режим стерилизации зависит от свойств газа и объема камеры аппарата. Предметами, простерилизованными этим методом, можно пользоваться не ранее, чем через 24 часа после стерилизации.

9. Стерилизация облучением ультрафиолетовыми, инфракрасными, рентгеновскими лучами, радиоактивным излучением используется для обработки помещений, оборудования, некоторых медицинских принадлежностей и пищевых продуктов. В микробиологической практике чаще других используется ультрафиолетовое облучение.

Методы дезинфекции

Для дезинфекции применяют физические и химические методы.

Физические методы.

1. Кипячение не менее 30 минут (часто в присутствии 1–2 % р-ра бикарбоната натрия). Дезинфицируют мелкие инструменты, предметные и покровные стекла.

2. Пастеризация при температуре 50–65º С в течение 5–10 минут с последующим быстрым охлаждением. Дезинфицируют напитки и пищевые продукты.

3. Воздействие УФ излучением с длиной волны 260–300 мкм. Дезинфицируют поверхности предметов, воздух помещений.

4. Гамма-излучение применяют для дезинфекции пластиковой посуды и медицинских инструментов одноразового использования.

Химические методы.

Обрабатывают объекты микробоцидными химическими веществами. Используют перекись водорода, хлорсодержащие соединения (0, 1–10 % р-р хлорной извести; 0, 5–5 % р-р хлорамина), формальдегид, фенолы (3–5 % р-ры фенола, лизола или карболовой кислоты)

Методы антисептики

В качестве антисептиков используют только малотоксичные для организма соединения, оказывающие антимикробное действие. Это 70 % спирт, 5 % р-р йода, 0, 1 % р-р перманганата калия, 0, 5–1 % спиртовые р-ры метиленового синего или бриллиантового зеленого, 0, 75–4 % р-р хлоргексидина, 1–3 % р-ры гексахлорофена и др. Эти вещества также добавляют к материалам, используемым при изготовлении перевязочных средств, лейкопластырей, зубных протезов, пломбировочных материалов и др.

Содержание лабораторной работы