Задание 4: Получение накопительных культур сапрофитных микроорганизмов

а) Получение накопительной культуры целлюлозоразрушающих бактерий. В большую стерильную пробирку с ватно-марлевой пробкой поместить 2–3 полоски фильтровальной бумаги и доверху долить питательной средой следующего состава: NH₄H₂PO_{4 (}0, 2г), MgSO₄•7H₂O (0, 05г), CaCl2 (0, 03г), пептон (0, 1г), KH₂PO₄ (0, 1г), CaCO₃ (0, 5г), вода 100 мл. Затем заразить среду бактериями, внося комочек почвы (богатой перегноем) или свежего конского навоза, закрыть пробкой и поместить в термостат при температуре 30º С на 7 дней. Под влиянием бактерий в анаэробных условиях фильтровальная бумага будет разлагаться.

б) Получение накопительной культуры пектиноразрушающих бактерий. Сделать снопик из сухих стеблей злаков длиной 4–5 см, перевязать его в двух местах ниткой. Для удаления экстрактивных веществ снопик погрузить в термостойкую колбу с водой и кипятить 10 мин. Затем снопик перенести в пробирку с водой, внести кусочек мела, и снова кипятить (над пламенем горелки), чтобы удалить из воды кислород. Закрыть ватной пробкой и поместить в термостат на 7 дней.

в) Получение накопительной культуры клубеньковых бактерий. В колбу налить питательную среду следующего состава: 100 мл бобового отвара, 0, 1 г KH₂PO₄, 0, 03 г MgSO₄•H₂O, 0, 2 г сахарозы. В фарфоровой чашечке растереть корневые клубеньки гороха или фасоли и поместить в колбу с питательной средой, закрыть ватной пробкой, поставить в термостат на 7 дней.

г) Получение накопительной культуры маслянокислых бактерий. Взять неповрежденные клубни картофеля (неочищенные), нарезать маленькими кусочками и положить в пробирку, добавить немного мела, доверху доливают водой, нагревают до 80º С, затем закрывают пробкой и помещают в термостат на 7 суток.

Контрольные ВОПРОСЫ

1. Дайте определение понятиям «факторы роста» и «ауксотрофы».

2. Приведите классификацию питательных сред по происхождению (по составу), по плотности и по назначению (с примерами).

3. Дайте понятие о происхождении, составе, принципах использования при составлении питательных сред для культивирования бактерий агара и желатины.

4. При помощи каких веществ можно удовлетворить потребности бактерий автотрофов и гетеротрофов в углероде?

5. При помощи каких веществ можно удовлетворить потребности бактерий в азоте?

6. Смеси каких веществ могут удовлетворить потребности бактерий в факторах роста?

7. Поясните причину изменения кислотности среды в процессе жизнедеятельности бактерий. Поясните принципы сохранения кислотности в процессе культивирования бактерий.

8. При какой кислотности среды культивируют большинство бактерий? На каких этапах приготовления питательных сред необходимо контролировать кислотность?

9. Какие приемы используют при культивировании аэробных и анаэробных бактерий?

10. Приведите классификацию микроорганизмов по отношению к температуре, поясните особенности культивирования различных групп микроорганизмов.

11. Перечислите особенности культивирования фотосинтезирующих и нефотосинтезирующих микроорганизмов.

12. Объясните необходимость присутствия в питательных средах свободной воды, опишите приемы повышения активности воды в средах.

13. Опишите методики периодического и непрерывного культивирования микроорганизмов в жидкой среде

2.2. Выделение чистых культур микроорганизмов.

Цель занятия

Познакомиться с методами и этапами выделения чистой культуры микроорганизмов, посева и пересева культур микроорганизмов.

Основные сведения

Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

Выделение чистых культур микроорганизмов и последующее изучение их свойств, физиологических и биохимических процессов, ими осуществляемых – один из важнейших приемов микробиологического анализа. Чистая культура – это культура, содержащая только один вид микроорганизма.

Методы выделения чистых культур основываются на разделении микробных смесей на отдельные клетки. Эти методы условно можно разделить на несколько групп:

1. Методы, основанные на механическом разобщении отдельных клеток микробов в питательных средах (используют при первичном выделении микроорганизмов из материала).

2. Методы предварительной обработки исследуемого материала физическими или химическими факторами, оказывающими избирательное антибактериальной действие или избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры различными факторами (например, при получении культур грамотрицательных бактерий в среды вносят антибиотики, подавляющие рост грамположительной микрофлоры).

3. Методы, использующие способность некоторых микроорганизмов быстро размножаться в организме чувствительных к ним лабораторных животных.

4. Выделение отдельных клеток под контролем глаза с помощью микроманипулятора.

Описанные методы не дают полной уверенности в чистоте выделенной культуры. Поэтому после выделения микроорганизмов в чистые культуры еще раз проверяют их чистоту. Для этого рассеивают их на плотные среды различного состава и наблюдают за характером и однородностью роста колоний. Одновременно проводят микроскопический контроль, при котором о чистоте культуры судят по однородности клеток в препарате.

Для выделения чистых культур патогенных микроорганизмов часто проводится заражение восприимчивых животных.

Чистые культуры сохраняются и поддерживаются в лабораториях, из них составляют коллекции микробных культур. Значение таких коллекций очень велико для развития микробиологии и связанных с ней отраслей науки и практики. Целью создания коллекции микробных культур является сохранение и поддерживание полезных свойств микроорганизмов – продуцентов БАВ, сохранение таксономических свойств эталонных культур, применяемых для идентификации вновь выделенных штаммов.

Сохранение жизнеспособности и поддержание свойств микроорганизмов в течение длительного времени сопряжено с большими трудностями. Поэтому ведутся непрерывные поиски наилучшего методов их хранения. Одним из первых и наиболее распространенных способов поддержания коллекций культур является метод периодических пересевов на свежие питательные среды. Однако по мере увеличения объема коллекцией это становится все более трудной задачей. Кроме того, в процессе пересевов микроорганизмов существенно изменяют свои свойства. Поэтому стали применять различные методы консервации культур: хранение на агаризованных питательных средах при температуре около 5⁰C в замороженном состоянии, под слоем вазелинового масла. Применяется также лиофилизация – высушивание из замороженного состояния с последующим хранением запаянных ампул в холодильниках.

Методы посева биологического материала

Культивирование микроорганизмов осуществляется посевом их на питательные среды с последующей инкубацией в оптимальных условиях. С этой целью материал, содержащий микроорганизмы (материал от больного, из чистой культуры, из изолированной колонии и т.д.), помещают (засевают) в жидкие или на плотные питательные среды. При использовании плотных сред посев может быть произведен как на поверхность, так и в глубину среды. В зависимости от техники посева и концентрации микробов в посевном материале на поверхности плотной питательной среды возникает сплошной рост микробов (бактериальный «газон» или «сливной рост) или изолированные колонии.

Универсальным инструментом для производства посевов является бактериологическая петля. Кроме нее для посева уколом используют бактериологическую иглу, а для посевов на поверхность плотной среды в чашки Петри – металлические, стеклянные или пластмассовые шпатели. Для посевов жидкого материала могут быть использованы пастеровские и градуированные пипетки. Способ посева в среду зависит от ее консистенции, качества засеваемого материала и цели исследования. Все манипуляции с микробами осуществляют с помощью стерильных инструментов вблизи пламени горелки.

Посев на твердую питательную среду производят легким втиранием материала в поверхность среды, не повреждая ее. При посеве на скошенную поверхность плотной питательной среды петлю с посевным материалом вносят в конденсационную воду и скользящими движениями растирают его штрихом по поверхности среды снизу вверх, направляя штрих от одной стенки к другой.

При посеве в столбик плотной питательной среды иглой с посевным материалом прокалывают столбик по центру и осторожно вынимают, не повреждая получившийся канал.

При посеве в жидкую питательную среду петлю погружают в среду или материал, растирают на стенке сосуда, а потом смывают жидкой средой, слегка встряхивая пробирку.

При посеве на плотные питательные среды в чашки Петри используют следующие методы:

- посев петлей - посевной материал втирают петлей в поверхность плотной среды у края чашки Петри, затем снимают избыток материала, проколов петлей среду. Оставшийся на петле материал рассевают параллельными штрихами по поверхности среды. При этом достигается последовательное уменьшение количества микробов вплоть до единичных клеток;

- посев шпателем - материал наносят на поверхность среды петлей или пипеткой, затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно и осторожно (чтобы не повредить поверхность среды) втирают в поверхность среды. При этом левой рукой придерживают слегка приоткрытую крышку и одновременно вращают чашку. При таком способе посева в зависимости от количества микробов в материале можно получить как изолированные колонии, так и сплошной газон. Можно нанести материал на крышку чашки Петри в конденсат, смешать шпателем с конденсатом, а затем втереть полученный раствор в поверхность среды (при таком приеме возрастает вероятность получить изолированные колонии микробов);

- посев тампоном - тампон с исследуемым материалом вносят в чашку с плотной питательной средой и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, одновременно вращая чашку.

Содержание лабораторной работы