Задание 4. Идентификация выделенного микроорганизмаВсе изученные культуральные, морфологические и физиолого-биохимические признаки выделенного в чистую культуру микроорганизма свести в общую схему и по имеющемуся определителю сделать попытку определить его систематическое положение. Схема описания культуры микроорганизмов 1. Источник, откуда был выделен микроорганизм. 2. Время выделения. 3. Схема выделения. 4. Морфология: а) форма вегетативных клеток и их сочетания; б) наличие слизистых капсул; в) подвижность вегетативных клеток (в бульонной культуре); г) окрашивание по методу Грама, кислотоустойчивость; д) способность к спорообразованию); 5. Характер роста на плотной среде (характер поверхности, цвет, выделение пигмента в среду, оптические свойства, запах, консистенция). 6. Рост по уколу в желатину (характер роста, наличие и форма разжижения, запах, цвет, выделение пигмента в среду). 7. Наличие амилолитических и пептолитических ферментов. 8. Рост в жидкой среде (степень помутнения, наличие осадка или поверхностно плёнки, их характеристика). 9. Способность к брожению. 10. Отношение к кислороду. 11. Систематическое положение. Контрольные ВОПРОСЫ 1. Что включает в себя характеристика физиолого-биохимических свойств? 2. Каким методом можно определить отношение культуры микроорганизма к молекулярному кислороду? 3. Какие биохимические особенности обычно определяют при лабораторном исследовании культуры микроорганизмов? 4. Какой рост по уколу в столбик агара дают микроаэрофилы и облигатные анаэробы? 5. Как определяют способность микроорганизмов к синтезу сахаролитических ферментов? 6. Как проводят определение амилолитических ферментов? 7. Как проводят определение протеолитических ферментов? 8. Какие питательные среды используют для определения амилолитических и пептолитических ферментов? 9. Каким способом можно определить способность микроорганизмов к брожению? 3.3. Определение чувствительности микроорганизмов Цель занятия Знакомство с методами определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Основные сведения Природные и синтетические антимикробные препараты используют для лечения инфекционных заболеваний. Для обеспечения надежного антимикробного эффекта необходимо производить подбор препаратов, обладающих наибольшей активностью в отношении выделенной культуры микроорганизмов. С этой целью в процессе микробиологической диагностики выделенной чистой культуры возбудителя проводят качественную и количественную оценку чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом дисков (диффузионный тест) Метод основан на подавлении роста микроорганизмов на плотной питательной среде под действием антимикробного препарата, нанесенного на бумажный диск (в продаже имеются готовые стандартные бумажные диски с широким ассортиментом современных препаратов в строго определенной концентрации, которую определяют исходя из терапевтических концентраций). В результате диффузии препарата в среду вокруг диска образуется градиент концентрации антибиотика – зона подавления роста микроорганизмов. Размер зоны подавления роста зависит от чувствительности бактерий и свойств препарата. Для проведения исследования готовят взвесь, содержащую стандартное количество жизнеспособных клеток, которую засевают газоном на поверхность плотной питательной среды (Мюллер-Хинтон или агар АГВ, не препятствующий диффузии препаратов) в чашки Петри. Диски с препаратами накладывают на посев на расстоянии 2, 5 см от центра чашки по кругу (на одну чашку не более 5 дисков). Посевы инкубируют 18–20 часов при 35º С. При соблюдении методики на фоне равномерного бактериального газона вокруг дисков образуются зоны подавления роста круглой формы. Учет результатов осуществляют путем измерения диаметра зоны подавления роста. За зону, подлежащую измерению, принимают тот участок, на котором рост бактерий полностью отсутствует. Интерпретацию полученных результатов осуществляют на основании критериев, приведенных в Приложении 2. Применение метода дисков имеет ряд ограничений. Метод пригоден только для определения чувствительности быстрорастущих бактерий, образующих в течение 24 часов гомогенный газон на стандартной плотной питательной среде достаточно простого состава (Мюллер-Хинтон или агар АГВ). В противном случае полученная информация будет недостоверной. Таким образом, метод дисков не может быть использован для определения чувствительности к антибиотикам всех медленно растущих и большинства прихотливых бактерий, к числу которых относятся многие возбудители болезней человека (Mycobacterium spp., Helicobacter spp., Bacteroides spp. и многие другие). Метод дисков не дает надежных результатов также при определении чувствительности бактерий к препаратам, плохо диффундирующим в агар, например, полипептидным антибиотикам (полимиксин, ристомицин). Количественное определение чувствительности бактерий Данный метод применяют для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) – наименьшей концентрации антибиотика, полностью подавляющей рост исследуемых бактерий. Готовят основной раствор антибиотика, содержащий препарат в определенной концентрации (мкг/мл или ЕД/мл) в физиологическом или буферном растворе или в специальном растворителе. Основной раствор используют для приготовления серийных (2-кратных) разведений антибиотика в питательной среде – бульоне (в объёме 1 мл) или агаре. Из исследуемой бактериальной культуры готовят суспензию стандартной плотности (чаще 103–105 м/о/мл) и засевают по 0, 1–0, 2 мл на среды с разной концентрацией антибиотика, а также на среду без препарата (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37º С 20–24 ч и более (для медленно растущих бактерий), после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательного бульона или появлению видимого роста бактерий на агаре, сравнивая с контролем. Наименьшая концентрация антибиотика, полностью подавляющая рост исследуемой культуры, принимается за МПК. Метод серийных разведений может быть использован для определения чувствительности к антибиотикам любых микроорганизмов, включая прихотливых и медленно растущих, а также облигатных внутриклеточных паразитов (хламидий, риккетсий и вирусов). В последнем случае антимикробные препараты в различных концентрациях добавляют в среду для культивирования клеток, после чего клетки заражают чистой культурой тестируемого вируса или бактерии. Результат оценивают по ЦПД или с помощью серологических реакций, позволяющих обнаружить накопление антигенов возбудителя в зараженных клетках. Чаще всего с этой целью применяют иммунофлюоресцентный метод (ИФ). Наименьшую концентрацию препарата, препятствующую развитию ЦПД или накоплению в клетках антигенов возбудителя, принимают за МПК. Интерпретацию результатов, т.е. оценку клинической чувствительности, осуществляют на основании критериев, приведенных в Приложении 2. Микротест–системы для определения чувствительности Микротест–системы предназначены для быстрого определения клинической чувствительности к антибиотикам бактерий определенных видов или родственных групп. Тестируемые препараты в стандартных концентрациях находятся в лунках готовых пластиковых планшетов. Определяют чувствительность исследуемой культуры к двум концентрациям каждого антибиотика: средней терапевтической и максимальной. Материал из изолированной колонии с помощью мерной бактериологической петли (объем 1 мкл) вносят в 5 мл стандартной питательной среды, содержащей индикатор, и готовят суспензию. Готовую бактериальную суспензию разливают в лунки планшета по 0, 1 мл и инкубируют при оптимальных для данного вида бактерий условиях температуры и газового состава среды. О росте бактерий судят по изменению цвета индикатора, что позволяет существенно сократить сроки исследования. Если бактерии сохраняют жизнеспособность в присутствии антибиотика, выделение продуктов метаболизма приводит к изменению цвета индикатора. Отсутствие изменения цвета свидетельствует о полном подавлении жизнедеятельности микроба. Результаты определяют через 4 ч инкубации с помощью спектрофотометра. Количественное определение чувствительности бактерий Е-тест представляет собой вариант диффузного метода, позволяющий определять МПК антибиотика. Вместо дисков используют стандартные полимерные полоски, приготовленные по специальной технологии (AB BIODISK) и содержащие иммобилизованные антимикробные препараты, нанесенные в виде непрерывного градиента концентрации. На другой стороне полоски Е-теста нанесена шкала значений МПК. При помещении полоски на поверхность агара регулируемый процесс диффузии обеспечивает создание в питательной среде вокруг полоски стабильного градиента концентрации препарата, соответствующего шкале. Процедура определения чувствительности с помощью Е-теста осуществляется аналогично тестированию методом дисков. После инкубации посева вокруг полоски образуется зона задержки роста, имеющая форму эллипса. Значение МПК соответствует месту пересечения эллипсовидной зоны с полоской Е – теста. Для интерпретации результатов (оценки клинической чувствительности) используют стандартные критерии (прил. 2). Содержание лабораторной работы
|
