И классификация хроматографических методов

Хроматографический метод анализа впервые был применен русским бота­ником М. С. Цветом в 1903 г. для разделения растительных пигментов. Разделение пигментов Цвет проводил в стеклянной колонке (трубке), на­полненной сухим твердым адсорбентом (СаС0₃). Сначала растительный материал обрабатывали органическим растворителем для экстракции пигментов. Полученный экстракт вводили в колонку. Компоненты экс­тракта перемещались по колонке с различной скоростью, образуя отдель­ные окрашенные кольца. При последующем промывании (элюировании) колонки растворителем вещества удалось полностью разделить. Для этого влажный адсорбент целиком извлекали из колонки, разрезали на отдель­ные столбики, из которых экстрагировали вещество, упаривали и иссле­довали остаток.

Современные автоматизированные хроматографические методы разде­ления имеют очень большие возможности и считаются классическими методами разделения органических и неорганических веществ. Эти мето­ды позволяют разделять органические соединения со сходной структурой и неорганические соединения с близкими химическими свойствами.

Хроматографические методы широко применяют в различных отраслях науки и техники, в том числе в биохимии и молекулярной биологии. Хро­матографические методы используются для решения следующих задач:

• разделение сложных смесей неорганических и органических ве­ществ,

• выделение индивидуальных веществ (белков, углеводов, витаминов, ферментов, липидов, аминокислот, органических кислот, антибио­тиков и др.) из сложных смесей,

• очистка индивидуальных веществ от примесей и смолы,

• концентрирование веществ из сильно разбавленных растворов, и др.

Хроматография основана на распределении компонентов смесей между двумя несмешивающимися фазами - неподвижной и подвижной. В ка­честве неподвижной фазы (носителя) используют твердое вещество или жидкость, нанесенную на твердый инертный носитель. Подвижной фазой служит газ или жидкость, которые содержат смесь разделяемых веществ. В зависимости от природы содержащей вещество фазы различают газо­вую (ГХ) и жидкостную (ЖХ) хроматографию. Из-за различия природы носителя число видов хроматографии увеличивается до четырех: газо­твердофазная (ГТХ), газо-жидкостная (ГЖХ), жидкостно-твердофазная (ЖТХ) и жидкость-жидкостная (ЖЖХ); другое название ЖТХ - пре­паративная колоночная хроматография.

Хроматографические методы разделения основаны на том, что отдель­ные компоненты смеси перемещаются по колонке с различной скоростью и достигают выхода через разные промежутки времени.

Растворитель (или газ), проходящий через колонку, называют элюен- том, процесс перемещения вещества вместе с элюентом - элюированием. Разработаны методы обнаружения и количественного определения раз­деляемых соединений, которые не обязательно должны быть окрашены. В современной колоночной хроматографии твердую фазу, как правило, не извлекают из колонки, а элюирование проводят до тех пор, пока от­дельные вещества не выйдут одно за другим из колонки. Каждый ком­понент регистрируют непосредственно на выходе из колонки с помощью разнообразных детекторов (фотометрических, потенциометрических, рефрактометрических и др.) или же собирают фракции компонентов смеси коллектором, а затем определяют количество вещества, выби­рая метод, пригодный для этой цели. Качественный состав отобранных фракций удобно контролировать методом тонкослойной хроматографии (ТСХ, разд. 4.1). Препаративная колоночная хроматография является од­ним из самых эффективных методов выделения органических веществ и разделения их смесей.

В органическом практикуме препаративная колоночная хроматография выполняется следующим образом. Перед началом разделения исследуют пробу раствора методом тонкослойной хроматографии (ТСХ, разд 4.1; желательно со стандартом). Иногда ТСХ проводят с целью выбора элюента, обеспечивающего наиболее эффективное разделение органи­ческих соединений. Затем определяют необходимое количество носи­теля (силикагель или оксид алюминия), насыпая его в сухую колонку. Отмеренный носитель высыпают в широкогорлую колбу или стакан и за­ливают элюентом. В колонку помещают небольшое количество элюента и затем наливают суспензию носителя в элюенте, следя за тем, чтобы твердая фаза равномерно заполняла колонку и не содержала пузырьков воздуха. Колонка готова. Кран или «заглушку» внизу колонки открывают, сливают элюент до уровня 1-2 мм над носителем и аккуратно, с неболь­шой высоты по стенкам колонки помещают раствор разделяемой смеси в элюенте (для этого удобно использовать пипетки с изогнутым концом). Выходящий из колонки раствор (элюат) собирают небольшими порциями, контролируя их состав методом ТСХ. Как правило, требуется собрать десятки фракций. По окончании выхода из колонки целевого соединения фракции, содержащие только это соединение, объединяют и упаривают на роторном испарителе.