Опыт 2. Количественное определение пировиноградной кислоты в моче

Пировиноградная кислота (ПВК) является одним из промежуточных продуктов обмена углеводов. В анаэробных условиях (при гипоксии) она восстанавливается в молочную кислоту, а в аэробных – подвергается окислительному декарбоксилированию и превращается в ацетил-КоА. ПВК – один из основных источников глюконеогенеза. Вследствие большой скорости реакции превращения пировиноградная кислота присутствует в тканях и биологических жидкостях в небольшом количестве. В крови ее содержание составляет 0, 5-1 мг /100 мл пирувата. Содержание пирувата в моче в норме составляет 2 мг /100 мл, суточное выведение его с мочой - 10-25 мг.

Наиболее резкое увеличение концентрации пирувата (ПВК) в крови и, как следствие, в моче, отмечается при мышечной работе и В₁- витаминной недостаточности. Это явление отмечается также при заболеваниях печени, сахарном диабете, сердечной декомпенсации, токсикозе и др.

Принцип метода: пируват с 2, 4-динитрофенилгидразином образует окрашенное соединение - 2, 4-динитрофенилгидразонпируват. Его экстрагируют из реакционной смеси толуолом. При добавлении спиртового раствора щелочи развивается красно-оранжевое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна количеству ПВК.

Ход работы: к 1, 0 мл мочи прилить 0, 5 мл 0, 1% 2, 4-динитрофенилгидразина, перемешать и через 5 минут добавить 2, 5 мл насыщенного водой толуола. После встряхивания в течение 1 мин оставить раствор до расслоения воды и толуола. Из верхнего толуолового слоя отобрать пробу объемом 1 мл сухой градуированной пипеткой и перенести в сухую пробирку, добавить 3 мл спиртового раствора КОН. Пробу с 1 мл стандартного раствора пирувата обрабатывают так же, как опытную. В контроле на реактивы моча замещается 1 мл воды. Через 10 мин пробы фотометрировать против контроля на реактивы при длине волны 400-415 нм на фотоэлектроколориметре.

Расчет проводится по формуле: Х=(D_о*50мг)/D_с, где: D_о – оптическая плотность опытного раствора, D_с – оптическая плотность стандартного раствора, 50 мг - концентрация стандарта пировиноградной кислоты, Х - концентрация пирувата в моче.