ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №3, №4

Тема занятия: «Основы приготовления питательных сред. Техника посева микроорганизмов на питательные среды. Бактериологический метод исследования»

Цели занятия: знакомство с классификацией питательных сред, этапами их приготовления, требованиями, предъявляемыми к ним.

Освоение техники посева микроорганизмов на питательные среды

Знакомство с бактериологическим методом исследования.

Самостоятельная работа:

1. Знакомство с классификацией питательных сред, этапами их приготовления, требованиями, предъявляемыми к ним.

2. Освоение техники посева на пластинчатые питательные среды петлей, шпателем, тампоном

3. Посев культур микроорганизмов из пробирки в пробирку с жидкими, полужидкими питательными средами, на скошенный МПА

4. Посев культуры микроорганизмов «газоном»

5. Знакомство с бактериологическим методом исследования

Методические указания:

Питательные среды предназначены для культивирования микроорганизмов. Требования, предъявляемые к питательным средам:

Среды должны быть:

1. питательными (содержать органогены (N, C, O_2,H_2,), макро- и микроэлементы, витамины и др. факторы роста)

2. изотоничными (содержание NаCl – 0,5%)

3. стерильными

4. свежеприготовленными

5. влажными, но не слишком вязкими

6. универсальными

7. иметь определенный рН (для большинства микроорганизмов он должен быть 7,2-7,4) и rH₂

Классификация питательных сред:

По происхождению:

1. естественные; 2. искусственные; 3. синтетические

По консистенции:

1. плотные; 2. жидкие; 3. полужидкие

Основой для приготовления плотных и полужидких сред являются жидкие, к которым добавляют уплотнители: желатин (используется и как уплотнитель, и усваивается микроорганизмами как питательное вещество), агар-агар (используется только как уплотнитель). При приготовлении плотных сред количество уплотнителя составляет 2-3%, а полужидких сред 0,2-0,5%.

По составу:

1. простые (МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода); 2. сложные, основой приготовления, которых является простые среды, к которым добавляют различные вещества (кровь, сыворотку, углеводы)

По назначению:

1. специальные – применяются для выращивания микроорганизмов, не растущих на простых питательных средах.

2. элективные – среды, на которых рост одних микроорганизмов подавляется, другие же получают возможность преимущественного роста.

3. дифференциально-диагностические, позволяющие по характеру роста отличить один вид микроорганизмов от другого.

4. консервирующие или транспортные – применяются для сохранения и транспортировки микроорганизмов

Этапы приготовления питательных сред: варка, определение рН, осветление, фильтрация, разлив, стерилизация, контроль готовых сред (включает в себя химический, биологический и контроль стерильности сред). Химический контроль предусматривает определение рН, количества NaCl, пептона, азота и др. Биологический контроль определяет ростовые свойства среды, контроль стерильности – отсутствие микроорганизмов в среде.

Техника посева микроорганизмов на питательные среды:

Все существующие методы посева преследуют одну цель: посеять материал так, чтобы из окружающей среды в него не попали посторонние микроорганизмы (в асептических условиях). Поэтому сеять надо быстро, но без резких движений, чтобы не усилить движение воздуха. Во время посева нельзя разговаривать. Посевы лучше проводить в боксе.

ПОСЕВ ИЗ ПРОБИРКИ В ПРОБИРКУ: Пробирку с посевным материалом и пробирку с питательной средой держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным пальцем так, чтобы края пробирки были на одном уровне, а их основания находились поверх кисти. В правой руке, как перо держат бактериальную петлю. Петлю вертикально прожигают в пламени спиртовки. Пробки из пробирки вынимают правой рукой, зажимая их между мизинцем и ладонью. Извлекают пробки плавно, легкими винтовыми движениями, края пробирок сразу обжигают в пламени горелки. Прокаленную петлю вводят через пламя горелки в пробирку с посевным материалом, охлаждают и набирают небольшое количество посевного материала, осторожно перенося его в пробирку со средой.

При посеве на жидкую среду петлю с посевным материалом слегка погружают в жидкость и растирают посевной материал на стекле пробирки, после чего смывают его средой.

При посеве на скошенный агар материал растирают петлей на поверхности среды зигзагообразным движением снизу вверх, начиная от границы конденсационной воды.

Если посев производят в полужидкую среду, разлитую в пробирку столбиком (полужидкий агар, сахарный ряд), то петлей с посевным материалом делают прокол столбика среды до дна, производят так называемый посев уколом. После посева петлю извлекают из пробирки, обжигают и, проводя пробирки через пламя спиртовки, закрывают пробками.

ПЕРЕСЕВ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПЛАСТИНЧАТОЙ СРЕДЫ В ЧАШКЕ ПЕТРИ В СРЕДЫ, РАЗЛИТЫЕ В ПРОБИРКИ: Чашку с посевным материалом ставят перед собой крышкой кверху. Первым и вторым пальцами левой руки слегка приоткрывают крышку, вводят под неё прокаленную петлю. Набрав посевной материал петлей из чашки закрывают крышку. В левую руку берут пробирку со средой. Посев производят так же, как с пробирки на пробирку. После посева чашку поворачивают вверх дном.

ПОСЕВ ШПАТЕЛЕМ НА ЧАШКИ ПЕТРИ С АГАРОМ: шпатель – это стеклянная или металлическая палочка или трубка, конец которой загнут в виде треугольника. Левой рукой слегка приоткрывают крышку, петлей или пипеткой наносят на поверхность среды посевной материал и тщательно втирают его круговыми движениями шпателя до тех пор, пока не перестанет свободно скользить по поверхности агара, левой рукой при этом придерживают крышку и одновременно вращают чашку. По окончании посева шпатель вынимают из чашки, закрывают крышку, стеклянный шпатель опускают в дез. раствор, а металлический прокалывают в пламени горелки. Засеянную чашку поворачивают вверх дном и помещают в термостат.

ПОСЕВ НА АГАРОВЫЕ СРЕДЫ ГАЗОНОМ: примерно 1 мл жидкой культуры микроорганизмов (если культура выращена на плотной питательной среде, её эмульгируют в физ. растворе или бульоне) наносят пипеткой на поверхность агара и тщательно распределяют жидкость по поверхности среды. Чашку слегка наклоняют и избыток посевного материла отсасывают пипеткой, выливая его в дезраствор. Туда же помещают пипетку.

ПОСЕВ НА АГАРОВЫЕ СРЕДЫ ТАМПОНОМ: тампон с посевным материалом вносят в слегка приоткрытую чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, вращая при этом тампон и чашку. Иногда посевной материал с тампона втирают на небольшой площадке питательной среды, а далее стерильной петлей рассевают его с площадки по оставшейся части среды зигзагообразными движениями.

ПОСЕВ НА АГАРОВЫЕ СРЕДЫ ПЕТЛЕЙ: небольшое количество посевного материала (иногда его предварительно эмульгируют в стерильном ИХН или бульоне) втирают петлей в поверхность среды у края чашки, несколько раз проводя петлей из стороны в сторону. Затем у того места, где закончились штрихи, агар прокалывают петлей, снимая избыток посевного материла. Оставшийся на петле посевной материал зигзагообразными движениями распределяют по всей поверхности среды. По окончании посева закрывают чашку и прожигают петлю.

Бактериологический метод исследования основан на выделении из исследуемого материала чистой культуры микроорганизмов, накоплении её, изучении её свойств (морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных) с целью последующей её идентификации. Чистая культура микроорганизмов – это популяция микроорганизмов одного вида, полученная из изолированной колонии. Изолированная колония – это потомство микроорганизмов, выросшее из одной микробной клетки.

Бактериологический метод включает 3 этапа исследования.

Цель 1 этапа – выделение из исследуемого материала чистой культуры микроорганизмов

Сущность 1 этапа: 1. приготовление мазка из исследуемого материала, окраска по Граму, микроскопия; 2. посев на пластинчатые питательные среды (метод механического разъединения) для выделения чистой культуры (либо биологический метод, либо использование устойчивости микроорганизмов к тем или иным факторам внешней среды).

Цель 2 этапа – накопление чистой культуры (биомассы)

Сущность 2 этапа: 1. характеристика изолированной колонии (форма, размер, поверхность, рельеф, контур края, структура, консистенция и цвет). Характер роста микроорганизмов на питательных средах называется культуральными свойствами.

Макроскопически в проходящем свете изучают а) форму колонии (правильная – круглая, овальная и неправильная – амебовидная, корневидная); б) размер (крупные 4-6 мм, средние 2-4 мм, мелкие 1-2 мм и точечные менее 1 мм); в) поверхность (гладкая или шероховатая, влажная или сухая, блестящая или матовая); г) рельеф (выпуклые, плоские, конусообразные, куполообразные, с центром приподнятым в виде соска и с валиком по периферии); д) цвет (неокрашенные и пигментированные). Микроскопически (с помощью лупы или микроскопа х8) изучают контур края (ровный и неровный – волнистый, зазубренный, эрозированный, бахромчатый), структуру (однородная, неоднородная, гиалиновая, зернистая и нитевидная)

Консистенцию колоний определяют посредством прикосновения бактериальной петлей (пастообразные, слизистые, волокнистые, хрупкие); 2. приготовление мазка из ½ части подозрительной колонии, окраска по Граму, микроскопия для изучения морфологических и тинкториальных свойств; 3. отсев оставшейся ½ части подозрительной колонии на среду накопления биомассы (скошенный МПА).

Цель 3 этапа – изучение свойств выделенной культуры с целью последующей идентификации.

Сущность 3 этапа: 1. проверка чистоты выделенной культуры – приготовление мазка, окраска по Граму, микроскопия (культура считается чистой, если в мазке обнаруживаются микроорганизмы одинаковой формы с одинаковым отношением к окраске по Граму); 2. изучение биохимических свойств: а) сахаролитических – способности ферментировать углеводы и многоатомные спирты (изучаются при посеве на сахарный ряд по изменению цвета среды и образованию пузырьков газа в толще среды); б) протеолитических – способности ферментировать белки (изучается при посеве на желатин, молоко, сыворотку, путем обнаружения выделения H₂S, индола, аммиака и др.); в) окислительно-восстановительных свойств (пробы на каталазу, оксидазу, редуцирующую способность); 3. изучение антигенных свойств путем постановки РА, РП и др. серологических реакций.

 

 

УО "МИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ";

Методическая разработка практического занятия №3 для учащихся отделения «Лечебное дело» по дисциплине: