Жидкостная хроматография; газовая хроматография. Газовая хроматография

А.Дж. Мартин и Р.Л.Синг впервые в 1941 г. предсказали возможность осуществления газожидкостной хроматографии. В 1949 г. Н.М. Туркельтауб описал хроматографическое разделение газов. Основы метода газовой хро­матографии были разработаны в 1952 г. А. Джеймсом и А.Дж. Мартином. Сущность метода. Газовая хроматография — процесс разделения компонентов смеси, основанный на различии в равновесном распределении компонентов между двумя фазами — газом-носителем (подвижная фаза) и либо твердой фазой, либо жидкостью, нанесенной в виде тонкой пленки на поверх­ность твердого носителя или стенки хроматографической колонки (жид­кая неподвижная, жидкая стационарная фаза). В первом случае метод называется газоадсорбционной хроматографией, во втором — газожид­костной (распределительной) хроматографией. Из этих двух вариантов газовой хроматографии наиболее распространена распределительная га­зожидкостная хроматография — ГЖХ. которая и рассматривается далее.Сущность метода ГЖХ состоит в следующем. Анализируемая смесь (обычно — раствор) летучих компонентов переводится в парообразное состояние и смешивается с потоком инертного газа-носителя, образуя с ним подвижную фазу — ПФ. Эта смесь проталкивается далее новой пор­цией непрерывно подаваемого газа-носителя и попадает в хроматографическую колонку, заполненную неподвижной (стационарной) жидкой фа­зой — НФ. Разделяемые компоненты распределяются между ПФ и НФ в соответствии с их коэффициентами распределения К, определяемыми формулой

К = с(НФ)/с(ПФ),

где с(НФ) и с(ПФ) — соответственно содержание (в г/мл) данного ком­понента в неподвижной и подвижной фазах, находящихся в динамиче­ском равновесии. Равновесный обмен хроматографируемого вещества между НФ и ПФ осуществляется в результате многократного повторения актов сорбция ↔ десорбция по мере движения ПФ вдоль НФ внутри хроматографической колонки. Поток газа-носителя увлекает с собой разделяемую парообразную смесь вдоль хроматографической колонки, так что процессы сорбция ↔ десорб­ция разделяемых компонентов повторяется многократно, причем каждый раз в системе устанавливается динамическое равновесие разделяемых веществ между ПФ и НФ. Эти многократные переходы разделяемых ве­ществ из ПФ в НФ и обратно совершаются по всей длине хроматографи­ческой колонки до тех пор, пока пары разделяемых веществ не покинут колонку вместе с газом-носителем. Поскольку сродство различных разделяемых веществ к НФ различно, то в процессе сорбционных — десорбционных переходов они задерживаются в НФ неодинаковое время. Чем выше температура кипения и относительная растворимость вещества в НФ, т.е. чем больше его коэффициент распреде­ления, тем дольше оно находится в НФ, тем позже покидает хроматографи- ческую колонку. В конце концов из хроматографической колонки вместе с газом-носителем выходят зоны (объемы) парообразных хроматографируе- мых веществ, разделенных полностью или частично. Если для двух компонентов смеси коэффициенты распределения (9.6) одинаковы, то они не разделяются. Если же их коэффициенты распределения различны, то разделение происходит, причем первым покидает колонку тот компонент, у которого коэффициент распределения наименьший. Пары разделенных компонентов вместе с газом-носителем поступа­ют в детектор хроматографа, генерирующий электрический сигнал — тем больший, чем выше концентрация компонента в парогазовой смеси. Электрический сигнал усиливается и фиксируется регистратором хрома­тографа в виде хроматограммы _у записываемой на диаграммной ленте или на мониторе компьютера (если таковым снабжен хроматограф). Эти хроматограммы и используются для качественной и количественной об­работки результатов анализа разделяемой смеси компонентов. Метод ГЖХ используют для разделения и определения летучих (ис­паряющихся при сравнительно невысоких температурах) веществ либо таких соединений, которые в результате тех или иных превращений мо­гут быть переведены в летучие продукты.Хроматографирование проводят на газовых (газожидкостных) хро­матографах различной конструкции. Газ-носитель (азот, гелий, аргон, водород) из баллона 1 через редук­тор поступает под некоторым давлением в блок подготовки газов 2, с помощью которого измеряются давление и скорость потока газа-носите­ля. В испаритель 5, температура которого поддерживается достаточной для быстрого испарения смеси, с помощью микрошприца вводится ана­лизируемая проба, которая испаряется и потоком газа-носителя увлекает­ся в хроматографическую колонку 5, находящуюся в термостате 4, тем­пература которого обычно несколько ниже, чем температура испарителя. После разделения смеси на зоны компонентов последние поступают в детектор 6, в котором генерируется электрический сигнал (тем больший, чем выше масса хроматографируемого компонента), усиливаемый усилителем 7 и преобразуемый реги­стратором 8 в виде записи хро­матограммы на бумаге само­писца. Анализируемая проба вво­дится в испаритель с помощью микрошприца, иглой которого прокалывается мембрана из термостойкой резины. В неко­торых хроматографах преду­смотрены дозаторы для ввода пробы. Объем вводимой пробы зависит от специфики используемой методики и для жидких проб состав­ляет 0,1—1 мкл, для газообразных — 0,5—5 мл. При большем объеме пробы обычно понижается эффективность хроматографической колонки. При представлении данных, полученных при проведении анализа методами ГЖХ, обычно указывают следующие характеристики: тип хро­матографа и детектора; материал, из которого сделана хроматографическая колонка, ее длина и внутренний диаметр; природа ПФ и твердого носителя; газ-носитель и скорость его потока; температура испарителя и термостата, который поддерживает постоянной температуру колонки; продолжительность анализа; способ обработки хроматограмм. Обязательным условием является предварительная проверка при­годности хроматографической системы для разделения данной смеси: достижение оптимальных параметров эффективности колонки и разделе­ния компонентов. При представлении результатов количественного анализа необходи­ма их статистическая обработка.

Высокоэффективная жидкостная хроматография. Несмотря на большие достоинства методов ГЖХ, они неприменимы для разделения и определения веществ с высокой молярной массой (больше ~300), нелетучих, термически нестойких, ионогенных соедине­ний. Эти недостатки отсутствуют в методе высокоэффективной жидкост­ной хроматографии — ВЭЖХ.

Высокоэффективная жидкостная хроматография, или жидкостная хроматография высокого давления, основана На тех же принципах, что и ГЖХ, только вместо газа-носителя в качестве ПФ применяется поток жидкости, не смешивающейся с жидкой НФ хроматографической колон­ки. Таким образом, в ВЭЖХ обе контактирующие фазы — НФ и ПФ — жидкости. Разделение компонен­тов основано на различии их ко­эффициентов распределения меж­ду НФ и ПФ. Температура хроматографи­ческой колонки может быть ком­натной, что позволяет хроматографировать белки, аминокислоты и другие термически нестойкие соединения. Молярная масса раз­деляемых веществ может достигать ~2000. На рис. 8 показана принципиальная блок-схема жидкостно­го хроматографа.

В ВЭЖХ используют как нормально-фазовый,так и обращенно-фазовый варианты. В первом случае полярность НФ полярности ПФ, во втором, наоборот, полярность НФ меньше полярности ПФ.В обращенно-фазовом варианте тфименяют твердый носитель из си- ликагеля с привитыми гидрофобными группами. В этих случаях в каче­стве ПФ используют смесь воды с низкомолекулярными спиртами или с ацетонитрилом.ВЭЖХ очень широко применяется для идентификации, разделения и определения самых различных веществ: оптически активных соединений,белков, нуклеиновых и аминокислот, полисахаридов, красителей, взрыв­чатых веществ, биологических сред, лекарственных препаратов и т.д. Метод используют для проведения профильного хроматографического анализа медицинско-биологических объектов в случаях патологических отклонений от нормы — так называемый «метод распознавания образов».При технологическом и фармакопейном контроле качества лекарст­венных субстанций и лекарственных форм ВЭЖХ стала одним из основ­ных методов определения как самих фармакологически активных ве­ществ, так и вспомогательных компонентов и посторонних примесей.Так, например, методом ВЭЖХ анализируют лекарственные препа­раты альдактон, амизол, вапьпроат натрия, глиборап, диклофенак натрия, козаар, кофеин, лидокаина гидрохлорид, мелоксикам, месалазин, параце­тамол, пилокарпина гидрохлорид, пирацетам, соталола и цетилпиридина гидрохлориды, флуконазол и многие другие.Жидкостная хроматография может проводиться в сочетании с масс-спектрометрией.