Индикаторы оксидиметрии. 10 страница

Метод прост по выполнению, однако обладает невысокой точностью и чувствительностью. Рефрактометрия используется при определении содержания многих веществ в растворах, например, органических жидкостей в водных рас­творах и в смесях, солей в водных растворах — хлорида, бромида, иодида натрия, бромида и иодида калия, хлорида кальция, гидрокарбоната, тиосульфата, цитрата, салицилата натрия, сульфата магния, лекарственных препаратов — амидопирина, аскорбиновои кислоты, гексаметилен-тетрамина, глюкозы, диэтиламида никотиновой кислоты в кордиамине, кодеина фосфата, кофеинбензоата натрия, новокаина, сульфацила рас­творимого, эфедрина и др.(Лекция № 30 и №9).

119. Хроматография. Классификация хроматографических методов анализа. В 1903 г. русский ученый М. С. Цвет сообщил о разделении окрашенных компонентов экстрактов из листьев растений на колонке, заполненной карбонатом кальция. Предложенный им термин «хроматография» происходит от греч. хромо — цвет и графа — записывать. В течение десятилетий опыты Цвета оставались незамеченными; позднее были предложены похожие методы, и сегодня известно несколько вариантов хроматографии. Наиболее общее определение хроматографических методов звучит так: хроматография — метод разделения компонентов, основанный на распределении этих компонентов между двумя фазами — неподвижной и подвижной (вовсе не обязательно, чтобы это происходило внутри колонки). ИЮПАК рекомендует использовать следующее определение: хроматография — физический метод разделения веществ, в котором разделяемые компоненты распределяются между двумя фазами, одна из которых неподвижна (неподвижная фаза, НФ), а другая движется в определенном направлении относительно первой (подвижная фаза, ПФ). Обычно неподвижная фаза находится в колонке, но она может быть нанесена и на плоскость. Разделение веществ с помощью хроматографии основано на различном сродстве разделяемых веществ к подвижной и неподвижной фазам. Различие в сродстве приводит к различию в скоростях движения частиц разделяемых веществ вместе с подвижной фазой и в конце концов к их разделению. На рис. 1 схематически изображен процесс разделения компонентов в хроматографической колонке.

Рис. 1. Принцип хроматографического разделения

 

Небольшой объем образца помещают в верхнюю часть колонки, заполненной частицами неподвижной фазы. Подвижная фаза (растворитель) подается в колонку сверху и медленно по ней передвигается. Хроматографические методы приобрели значение при разделении и анализе сложных смесей, существенно расширив возможности аналитической химии Хроматографические методы - фармакопейные и включены во все Фармакопеи.

Классификация хроматографических методов анализа. Существуют различные подходы к классификации хроматографических методов. Рассмотрим важнейшие из них. Классификация по механизму разделения веществ. Хроматографические процессы можно классифицировать по типам устанавливающихся равновесий, которые зависят от природы неподвижной фазы. Основные виды равновесий — это адсорбция, распределение, ионный обмен и проникновение во внутренние поры.

а) Адсорбци­онная хроматография — основана на использовании неодинаковой спо­собности разделяемых компонентов вступать в специфическое взаимо­действие с поверхностью адсорбента — НФ — за счет адсорбции. В этом виде хроматографии неподвижная фаза является твердым веществом, на котором адсорбируются компоненты пробы. Подвижная фаза может быть жидкостью (жидкостно-твердофазная хроматография) или газом (газо-твердофазная хроматография); компоненты распределяются между двумя фазами в результате протекания процессов сорбция/десорбция. Тонкослойная хроматография (ТСХ) — отдельный вид адсорбционной хроматографии, в котором неподвижная фаза является плоскостью, так как она нанесена на инертную пластинку, а подвижная фаза является жидкостью.Тонкослойная хроматография (ТСХ) представляет собой планарную разновидность хроматографии, подходящую для проведения широкомасштабных качественных скрининговых анализов, а также количественных определений. В качестве неподвижной фазы применяют тонкий слой мелкодисперсного адсорбента, нанесенного на стекло, алюминиевую пластинку или пластиковую полоску. Можно использовать любой сорбент, применяемый в колоночной хроматографии, при наличии подходящего связующего состава для оптимального контакта с поверхностью пластинки.Каплю образца наносят на пластинку микропипеткой и далее «развивают» хроматограмму помещением нижней части пластинки или полоски (но не точки с образцом) в подходящий раствор. Растворитель поднимается вверх по пластинке под действием капиллярных сил, при этом компоненты пробы поднимаются с разными скоростями, в зависимости от их растворимости и степени удерживания на неподвижной фазе. После окончания развития хроматограммы отмечают пятна разделенных компонентов раствора или же переводят их в видимую форму путем обработки реагентом, образующим с разделенными компонентами окрашенные продукты. Точки перемещаются с определенной скоростью, меньшей скорости растворителя, и эта скорость характеризуется параметром R_f:

где расстояние измеряют от середины точки нанесения пробы в нижней части пластинки. Фронт подвижной фазы будет представлять собой прямую, пересекающую пластинку. Расстояние, пройденное растворенным веществом, измеряют в центре его пятна или места с максимальной его плотностью, если наблюдается размывание. Величина R_f таким образом, зависит от используемых подвижной и неподвижной фаз. Поскольку данные по разным пластинкам всегда немного отличаются, желательно определять R_f в каждом отдельном случае.

Неподвижные фазы в тонкослойной хроматографии обычно представляют собой тонкие порошки (с размером частиц от 10 до 50 мкм), в качестве которых могут быть использованы адсорбенты, ионообменники, молекулярные сита, или же подложки для нанесения пленки жидкости, т. е. те же неподвижные фазы, что и в колоночной хроматографии. Сначала готовят водную суспензию порошка с добавлением такого связующего состава, как алебастр, гипс или поливиниловый спирт, способствующего надежному удерживанию на носителе. Далее суспензию распыляют на пластинку тонким слоем, обычно толщиной от 0,1 до 0,3 мм, с помощью специальных распыляющих насадок, обеспечивающих постоянную толщину. Такие насадки имеются в серийном производстве. Затем испаряют растворитель, а адсорбент активируют выдерживанием при 110 в течение не-скольких часов. Обширный выбор пластинок и полосок для ТСХ также имеются в серийном производстве. В качестве неподвижных фаз наиболее часто используются адсорбенты, наиболее распространенными из которых являются силикагель, оксид алюминия, а также порошкообразная целлюлоза. Сорбенты на основе оксида алюминия более предпочтительны для разделения малополярных соединений, в то время как силикагели подходят для разделения полярных веществ, таких как аминокислоты и сахара. Также в качестве сорбентов можно использовать силикаты кальция и магния, а также активный древесный уголь. Подвижные фазы для ТСХ. В адсорбционной хроматографии наблюдаются те же закономерности, что и в колоночной: элюирующая сила подвижной фазы возрастает с увеличением полярности (например, гексан < ацетон < спирт < вода). По возможности в качестве подвижной фазы следует использовать либо одно соединение, или хотя бы двух-трехкомпонентную смесь, поскольку смешанные подвижные фазы имеют тенденцию к изменению состава по мере продвижения вверх по пластинке. Последнее может привести к варьированию значений R_f зависимости от расстояния, пройденного пятнами на пластинке. Раствор, применяемый в качестве подвижной фазы, должен состоять только из очень чистых компонентов. Присутствие малых количеств воды или других примесей способно повлиять на воспроизводимость хроматограмм. С помощью метода ТСХ можно не только открывать, но и количест­венно определять содержание компонентов в смесях. Для этого либо ана­лизируют сами пятна на хроматограмме, либо извлекают разделенные компоненты из хроматограммы тем или иным способом (экстракцией, элюированием подходящими растворителями). Относительная ошибка количественного определения вещества ме­тодом ТСХ составляет 5—10%. ТСХ — фармакопейный метод и широко применяется для анализа и контроля качества разнообразных лекарственных средств. б) Распределительная хроматография — основана на использовании различий в коэффициентах распределения разделяемых компонентов между ПФ и НФ, представляющей собой жидкость. За коэффициент распределения принимают отношение равновесной концентрации хроматографируемого вещества в более полярной фазе (с большей диэлектрической проницаемо­стью) к равновесной концентрации того же вещества в менее полярной жид­кой фазе (с меньшей диэлектрической проницаемостью). В распределительной хроматографии неподвижная фаза — это жидкость, которую наносят на твердое инертное вещество. Подвижная фаза в этом виде хроматографии может быть жидкостью (жидкостно-жидкостная распределительная хроматография) или газом (газожидкостная хроматография, ГЖХ). В обычном варианте жидкостно-жидкостного распределения используют полярную неподвижную фазу (например, метанол, нанесенный на кремнезем) и неполярную подвижную фазу (например, гексан). В результате полярные соединения удерживаются, а неполярные элюируются. Такой вариант называют нормально-фазовой хроматографией. Если применяют неполярную подвижную фазу и полярную подвижную фазу, то лучше удерживаются неполярные вещества, а полярные вещества легко элюируются. Этот вариант называют обращенно-фазовой хроматографией, и он более распространен.

К распределительной хроматографии относится бумажная хромато­графия (или хроматография на бумаге) в ее обычных вариантах. В этом методе вместо пластинок с тонким слоем сорбента, употребляемых при ТСХ, применяют специальную хроматографическую бумагу, по которой, пропитывая ее, перемещается жидкая ПФ во время хроматографирования от линии старта до линии финиша растворителя. Бумажная хроматография подобно методу ТСХ применяется качественном, так и в количественном анализе. Для количественного определения содержания того или иного ком­понента смеси применяют различные методы: 1) исходят из наличия оп­ределенной зависимости (пропорциональной, линейной) между количе­ством вещества в пятне и площадью пятна (часто при этом предваритель­но строят градуировочный график); 2) взвешивают вырезанное пятно с веществом и такую же по площади чистую бумагу, а затем по разности находят массу определяемого вещества; 3) учитывают связь между ин­тенсивностью окраски пятна и содержания в нем определяемого компо­нента, придающего окраску пятну. В ряде случаев вещества, содержащиеся в пятнах, экстрагируют ка­ким-либо растворителем и затем анализируют экстракт.

Бумажная хроматофафия — фармакопейный метод, используется для разделения смесей, содержащих как неорганические, так и органиче­ские вещества. Метод доступен, прост по выполнению, однако в целом он уступает более современному методу ТСХ, в котором применяется тонкий слой сорбента. Как адсорбционная, так и распределительная ВЭЖХ основаны на различии в полярности растворов, поскольку и сорбируемость, и растворимость определяются полярностью веществ. Процессы распределения между двумя несмешивающимися жидкостями достаточно чувствительны даже к незначительным изменениям в молекулярной массе аналитов, поэтому их предпочитают использовать для разделения веществ, принадлежащих к гомологическому ряду. С другой стороны, процессы адсорбции чувствительны к стерическим эффектам в молекулах аналитов, и поэтому они удобны для разделения изомеров, имеющих различную пространственную конфигурацию. Для адсорбционного варианта ВЭЖХ в качестве сорбентов применяют частицы оксидов алюминия или кремния. Высокополярные соединения разделяют, главным образом, в варианте распределительной хроматографии, в то время как неполярные соединения — в варианте адсорбционной хроматографии. Для аналитов средней полярности можно осуществлять оба варианта ВЭЖХ.

в) Ионообменная хроматография — основана на использовании раз­личной способности ионов разделяемых компонентов, находящихся в ПФ (обычно — это жидкий раствор), к обмену с ионами НФ. В ионообменной хроматографии в качестве неподвижной фазы используют ионообменную смолу. Механизм разделения основан на ионообменных равновесиях. В отличие от многих других типов хроматографии, используемых главным образом для разделения органических веществ, ионообменная хроматография особенно подходит для разделения неорганических ионов, причем как катионов, так и анионов, поскольку это разделение основано на ионном обмене в неподвижной фазе. Данный метод оказался весьма полезным для разделения аминокислот. Неподвижная фаза в ионообменной хроматографии состоит из шариков сополимера стирола и дивинилбензола. Этот сшитый полимер (смола) имеет в своей цепи свободные фенильные группы, которые можно модифицировать с целью введения ионных функциональных групп. Подобно эксклюзионной хроматографии, в ионообменной хроматографии применяются набивные колонки как для разделения под действием силы тяжести, так и в варианте ВЭЖХ. В последнем случае метод разделения называют ионной хроматографией.

г) Хемихроматография — основана на использовании различной способности компонентов разделяемой смеси вступать в те или иные хи­мические реакции с реагентами, входящими в состав НФ. При этом раз­личают такие виды хемихроматографии, как осадочная, окислительно- восстановительная, лигандная (комплексообразовательная), биоспеци­фическая хроматография. Иногда ионообменную хроматографию рассматривают как частный случай хемихроматографии, учитывая, что она основана на обратимой хемосорбции ионов на НФ.

д) Эксклюзионная (ситовая, проникающая) хроматография — осно­вана на использовании различий между размерами (эффективными диа­метрами) частиц разделяемых компонентов и размерами пор НФ, которая представляет собой сорбент — пористое вещество. В эксклюзионной хроматографии сольватированные молекулы разделяются по размерам и способности проникать через ситообразную структуру неподвижной фазы Сорбенты здесь иг­рают роль молекулярных сит; они проницаемы только для частиц опре­деленных размеров. Мелкие частицы проникают в поры сорбента и удерживаются там, а крупные — уносятся вместе с ПФ, не удерживаясь на сорбенте. Разновидность — гель-храматография ( здесь неподвижная фаза представляет собой набухший гель с порами определенного размера).

е) Другие хроматографические методы, например, электрохрома­тография (электрофорез), основанная на использовании неодинаковой способности разных ионов в растворе перемещаться под действием внешнего электрического поля.

Классификация по агрегатному состоянию фаз. ПФ может пред­ставлять собой газ или жидкость, а НФ — твердое вещество или жид­кость. В зависимости от природы контактирующих ПФ и НФ хрома­тографические методы подразделяют так, как указано в табл. 1.

Наиболее широко применяются газовая хроматография (ГХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Классификация по технике эксперимента. Обычно различают ко­лоночную, капиллярную, плоскостную (тонкослойную, бумажную) хроматографию. В случае колоночной хроматографии для разделения компонентов используют хроматографические колонки, заполненные тем или иным сорбентом. В капиллярной хроматографии в качестве хроматографических коло­нок применяют капиллярные трубки из стекла или другого материала. При плоскостной хроматографии неподвижной фазой служит либо тон­кий слой сорбента, нанесенный на плоскую поверхность — стеклянную, алюминиевую, пластмассовую пластинку (тонкослойная хроматография, хроматография в тонком слое сорбента), либо бумага — чаще всего спе­циальная хроматографическая бумага, волокна которой покрыты тонким слоем воды или другой жидкости (бумажная хроматография, хромато­графия на бумаге). Вдоль плоской поверхности сорбента (НФ) перемеща­ется за счет капиллярных сил жидкая фаза — раствор, содержащий смесь разделяемых компонентов. Классификация по способу относительиого перемещения фаз (по способу получения хроматограммы). В рамках этой классификации кратко рассмотрим разновидности колоночной хроматографии — фрон­тальную, элюентную (проявительную), вытеснительную хроматографию.В лабораторных условиях хроматографическая колонка обычно представляет собой стеклянную трубку с краном на выходе, заполненную сорбентом. Через колонку сверху пропускают жидкую ПФ с.необходи­мой скоростью (часто — около 20 капель в минуту).

а) Фронтальная хроматография. При этом способе хроматографи- рования в заполненную сорбентом хроматографическую колонку непрерывно вводят анализи­руемый раствор, содержа­щий, помимо растворителя Е, разделяемые компоненты А и Б, вплоть до окончания процесса хроматографирования. В начале хроматографирования из колонки выходит чистый растворитель Е. Компонент А, обладающий меньшим сродством к сорбенту (НФ), чем компонент Б, перемещается быстрее компонента Б и опережает его. Затем из колон­ки выходит раствор компонента А в растворителе Е. Компонент Б «от­стает» от зоны компонента А. В дальнейшем из колонки выходит смесь растворителя Е с обоими компонентами А и Б. Фронтальная хроматография позволяет отделить только часть одно­го компонента (в данном случае — компонента А), поскольку в колонку непрерывно поступает смесь обоих компонентов.

б) Элюентная (проявительная) хроматография. Вначале в хроматографическую колонку, заполненную сорбентом, вводят раствор разделяемых веществ А и Б в растворителе Е. Затем эти вещества вымывают (элюируют) чистым растворителем (э люентом) Е.

При элюировании чистым растворителем Е компоненты А и Б пере­мещаются вдоль сорбента (НФ) с различной скоростью. Компонент А, обладающий меньшим сродством к НФ, переносится быстрее компонента Б, обладающего более высоким сродством к НФ. При достаточной длине колонки компоненты А и Б полностью разделяются: вначале элюируется зона компонента А, затем — зона чистого растворителя Е и, наконец, зона компонента Б. Процесс вымывания компонентов называют э люированием. Раство­ритель (или раствор), применяемый для элюирования, называют элюентом, а выходящий из колонки раствор (или растворитель) — элюатом. Элюентная хроматография позволяет практически полностью разде­лить компоненты анализируемой смеси. К недостаткам метода можно отнести разбавление компонентов А и Б растворителем Е на выходе из хроматографической колонки, что при­водит к уменьшению их концентрации в элюате.

в) Вытеснительная хроматография. Этот метод отличается от пре­дыдущего тем, что в качестве эгаоента применяют не чистый растворитель Е, а некоторое вещество В (например, его раствор в Е), у которого сродство к сорбенту (НФ) больше, чем у компонен­тов А и Б. Вещество В играет, таким образом, роль вытесни­теля: оно вытесняет компо­ненты А и Б из НФ.

В хроматографическую колонку вводят смесь разделяемых компонен­тов А и Б с растворителем Е, после чего прибавляют раствор вытеснителя В в растворителе Е. По мере элюирования вначале в элюат поступает чистый растворитель Е, затем последовательно Е + А, Е + А + Б, Е + Б, Е + Б + ВиЕ + В. Таким образом, наряду с зонами разделенных компонентов А и Б (разбавленных растворителем Е), в элюат переходят и разбавленные растворителем зоны смеси компонентов А + Б и Б + В.

120. Ионообменная хроматография. Основателем ионообменной хроматографии считается У. Самуэльсон, который, начиная с 1939 г., опубликовал серию работ по разделению катионов, анионов методами ионообменной хроматографии. Термодина­мическая теория метода развита Б.П. Никольским. Г. Штаудингер пока­зал возможность сополимеризации стирола и дивинилбензола, что от­крыло пути получения ионообменников на основе полимерных цепей, сшитых поперечными связями, с введением в них ионогенных групп.Сущность метода. Метод ионообменной хроматографии основан на использовании яв­ления ионного обмена между неподвижной твердой фазой — ионообменником (сорбентом) и подвижной жидкой фазой — раствором, содер­жащим ионы, обмениваемые с ионами сорбента.

Ионный обмен — это гетерогенный процесс, при котором сорбент и находящийся с ним в контакте раствор обратимо и стехиометрически обменивается одноименно (одного и того же знака) заряженными ионами. В качестве сорбентов используют ионообменники — иониты, пред­ставляющие собой обычно нерастворимые в воле твердые фазы. Иониты состоят из матрицы, в которой распределены ионогенные группы, включающие фиксированные, прочно связанные в матрице, ионы, и менее прочно связанные противоионы (т.е. ионы противоположного знака), способные к отщеплению от ионита и к переходу в раствор. Эти противоионы могут обмениваться с одноименными (катионы — с катионами, анионы —с анионами) ионами раствора. Иониты, обменивающиеся катионами раствора, называются катио- нитами (катионообменниками), а иониты, обменивающиеся анионами раствора, — анионитами (анионообменниками). Известны также амфотерные иониты (амфолиты), способные об­мениваться с раствором как катионами, так и анионами. Разделение ионов осуществляется за счет различной способности разделяемых ионов к ионному обмену с ионитом. Реакции ионного обмена можно схематически проиллюстрировать следующими примерами.

В рассматриваемом случае катионит в Н-форме (в Н⁺-форме, в ки­слой форме) состоит из матрицы R (основы органического полимера — полимерной смолы) и ионогенной группы –SO₃H⁺. Отрицательно заря­женные группы –SO₃^- прочно связаны ковалентной связью с матрицей и в условиях ионного обмена отщепляться не могут. Напротив, противоио­ны — положительно заряженные катионы водорода Н⁺ — могут отщеп­ляться от исходной ионогенной группы. Их замещают катионы металла М⁺, которые переходят из раствора в фазу сорбента и удерживаются в ионогенной группе –SO₃M⁺. В целом осуществляется катионный обмен, при котором катионы металла М⁺ ранее входящие в состав подвижной фазы — раствора, остаются на катионите, а катионы водорода Н⁺ перехо­дят в раствор и уносятся подвижной фазой.

Анионный обмен происходит аналогично. В рассматриваемом слу­чае анионит в основной форме, т.е. содержащей гидроксильные группы ОН^-, состоит также из матрицы R и ионогенной группы –N(NH₃)₃^+OH-. Эта группа включает положительно заряженный катион –N(NH₃)₃⁺, прочно связанный в матрице ковалентной связью и не способный к отщеплению в условиях ионного обмена, и отрицательно заряженный противоион ОН^-, который, напротив, способен к отщеплению от ионогенной группы и к обмену с анионами А раствора. В результате такого обмена анионы А^- переходят в ионогенную группу анионита и удерживаются в ней, а группы ОН^-, перешедшие в раствор в подвижную фазу, уносятся вместе с нею. В целом происходит анионный обмен.Кроме ионитов, обладающих кислотно-основными свойствами, из­вестны также сорбенты, проявляющие окислительно-восстановительные и комплексообразующие свойства.

Ионообменная хроматография используется для разделения электро­литов, их очистки от примесей, извлечения и концентрирования, количе­ственного определения, получения кислот, оснований, солей, для выде­ления редкоземельных металлов, для очистки сахара, при анализе многих лекарственных препаратов — таких, как атропина сульфат, мезатон, па­паверина гидрохлорид, сальсолина гидрохлорид, скополамина гидробро­мид, тифен, фенадон, хинина гидрохлорид, эфедрина гидрохлорид и др.

Определение лекарственных препаратов. Для определения в препара­тах содержащихся в них лекарственных веществ, представляющих собой соли органических оснований — гидрохлориды, гидробромиды (папаверина, сальсолина, хинина гидрохлориды), методами ионообменной хроматографии используют катионообменники, например, катионит СДВ-3.Для проведения анализа навеску препарата массой ~0,05—0,10 г рас­творяют в 5—10 мл дистиллированной воды. Полученный раствор про­пускают через катионит в Н-форме со скоростью вытекания ~30 капель в минуту. После этого через колонку пропускают дистиллированную воду до нейтральной реакции вытекающего элюата по лакмусу. Объединяют элюат и промывные воды, содержащие ионы водорода, т.е. кислоту, в количестве, эквивалентном количеству сорбированных на катионите ка­тионов соответствующего лекарственного препарата, и титруют кислоту стандартным 0,1 моль/л раствором щелочи в присутствии индикатора метилового оранжевого.