ВОЛОКОННАЯ ОПТИКА.

1. Оптический микроскоп. Ход лучей. Увеличение.

 

Для получения больших увеличений в качестве лупы следует использовать короткофокусные линзы. Однако такие линзы имеют небольшие размеры, им свойственны значительные аберрации, что накладывает ограничения на их увеличения. Значительное увеличение можно получить, рассматривая в лупу действительное изображение предмета, созданное дополнительной линзой или системой линз. Такой оптической системой является микроскоп, в простейшем случае состоящий из 2-х линз. Лупу в этом случае называют окуляром, а дополнительную линзу или систему линз – объективом. Они располагаются друг от друга на расстоянии 15-20 см. Обычно объектив биологического микроскопа состоит из системы короткофокусных линз, которая уменьшает сферическую и хроматическую аберрации. Окуляр микроскопа состоит из нескольких линз, обычно из двух. Рассматриваемый объект АВ (рис.1) помещается на расстояние d вблизи фокуса объектива. Его действительное и перевёрнутое изображение А₁В₁ получается на расстоянии f от объектива. Окуляр располагается таким образом, чтобы изображение А₁В₁ находилось между передним фокусом F₂ и окуляром. Его рассматривают в окуляр как в лупу. Окончательное изображение получается мнимым, увеличенным и обратным относительно самого рассматриваемого объекта.

Положение объектива относительно объекта подбирается так, чтобы окончательное изображение А₂В₂ располагалась от глаза на расстоянии наилучшего зрения a ₀=25 см. Расстояние между внутренними фокусами объектива и окуляра называется оптической длиной тубуса (Δ). Оптическая длина тубуса обычно короче геометрической длины L на сумму фокусных расстояний F₁ и F₂. Увеличение микроскопа равно произведению увеличений объектива и окуляра Г=Г_ОБ·Г_ОК. Окуляр в микроскопе используется как лупа и его увеличение определяется по формуле . Увеличение же объектива можно найти, учитывая, что линейное увеличение линзы () равно отношению расстояния от ее оптического центра до изображения (f) и до предмета d. Применяя эту формулу к объективу микроскопа, можно считать, что d= F₁, f= F₁+Δ,или пренебрегая фокусным расстоянием объектива F₁ по сравнению с оптической длиной тубуса (последняя примерно в десять раз больше), можно считать, что f≈Δ. Тогда увеличение объектива: . Следовательно, увеличение микроскопа: , т.е. увеличение микроскопа равняется отношению произведений оптической длины тубуса на расстояние наилучшего зрения к произведению фокусных расстояний объектива и окуляра.

Увеличение объектива и окуляра называются их собственными увеличениями и указываются на оправе линз.

 

2. Разрешающая способность и полезное увеличение

микроскопа.

Соответствующим подбором линз можно обеспечить весьма большое увеличение микроскопа. Однако на практике редко используют увеличение, превышающее 1500-2000 раз. Это объясняется тем, что возможность различать мелкие детали объекта нарушается дифракционными явлениями, которые ограничивают полезное увеличение микроскопа. При прохождении света через мельчайшие детали предмета изображение их вследствие дифракции может терять резкость, может возникнуть нарушение геометрического подобия предмета, и, наконец, возможно полное исчезновение изображения. Чтобы детально выяснить причины данного явления, ознакомимся с понятиями: «разрешающая способность», «предел разрешения», «полезное увеличение».

Разрешающая способность (R) – это способность микроскопа давать раздельные изображения мелких деталей рассматриваемого объекта.

Предел разрешения (Z) – это такое наименьшее расстояние между двумя точками объекта, когда эти точки видны в микроскопе раздельно. Разрешающая способность обратна пределу разрешения . Разрешающая способность микроскопа обусловлена волновыми свойствами света, поэтому выражение для предела разрешения можно получить учитывая дифракционные явления.

Дифракционная теория разрешающей способности микроскопа разработана Э.Аббе, Л.Мандельштамом и Д.Рожденственским. Разрешающая способность микроскопа в целом определяется разрешающей способности объектива, в который непосредственно входят лучи света, дифрагированные на объекте.

Основным элементом, обуславливающим разрешающую способность объектива, является его апертурный угол α (рис.2), равный половине угла, образованного лучами, идущими от препарата к краям объектива (отверстный угол U). Апертурный угол определяет угловой размер объектива и играет большую роль в достижении большой разрешающей способности микроскопа. Рассмотрим образование с помощью объектива изображения светящегося отверстия S достаточно малого диаметра d, на которое падает пучок параллельных монохроматических лучей (рис.3). Проходя через отверстие, свет испытывает дифракцию. Объектив собирает лучи и в сопряжённой плоскости образует в точке A изображение отверстия . Возможны два случая:

1) Апертурный угол α объектива больше угла дифракции φ или равен ему (α≥φ), тогда все дифрагирующие лучи принимают участие в формировании изображения и оно будет подобно предмету.

2) Апертурный угол α<φ, тогда не все исходящие из отверстия лучи примут участие в образовании изображения предмета. Изображение не будет полностью геометрически подобно предмету.

Степень нарушения изображения будет зависеть от того, какая часть дифрагирующих лучей не попадает в объектив и не принимает участие в образовании изображения. Угол φ дифракции лучей тем больше, чем больше длина волны λ и чем меньше диаметр d отверстия. Тогда в предельном случае, когда α= φ, можно установить аналогичное соотношение , откуда .

Таким образом, диаметр отверстия, при котором сохраняется подобие изображения предмету, может быть тем меньше, чем короче длина волны и чем больше апертурный угол.

Перенеся рассуждения на условия микроскопирования, можно считать, что диаметр d отверстия соответствует наименьшему размеру структурных деталей препарата, т.е. приравнять его к пределу разрешения объектива микроскопа Z=d. Тогда аналогичное утверждение можно привести относительно разрешения объектива.

В теории Аббе в качестве микроскопируемого объекта рассматривается дифракционная решётка. В оптических устройствах, в том числе и в микроскопе, пучки света всегда ограничены, поэтому важно знать, как это повлияет на искажение изображения предмета, какое минимальное количество лучей способно передавать полную информацию о предмете. Аббе в своих опытах экранировал в плоскости F собирающей линзы часть лучей, дающих изображение дифракционной решётки. Он установил, что для разрешения щелей в изображении дифракционной решётки, полученном с помощью линзы на экране, необходимо, чтобы в образовании её изображения участвовали лучи от максимумов нулевого и первого порядков, хотя бы с одной стороны. В предельном случае, согласно Аббе, крайними лучами ограниченного конического светового пучка будут лучи, соответствующие центральному (нулевому) и 1-му главному максимуму. Предел разрешения в этом случае может быть приравнен периоду дифракционной решётки (d). Тогда, используя формулу дифракционной решётки , (к=1; φ =α; d=Z) для перпендикулярного падения лучей в воздухе можно записать: ; т.е. предел разрешения при прямом падении лучей численно равен отношению длины волны света к синусу апертурного угла объектива.

Пусть свет падает на дифракционную решётку под углом падения , равным апертурному углу (рис.4). В этом случае формула дифракционной решётки будет иметь вид: . Так как sin(-α) = -sinα, из этой формулы при и получим или . Если свет распространяется не в воздухе, а в среде с показателем преломления n, то (λ – длина волны света в воздухе).

В этом случае предел разрешения запишется:

.

При другом подходе к выводу формулы для определения предела разрешения при наклонном падении лучей на объектив эта формула имеет вид: , где величину называют числовой апертурой.

Из этой формулы для Z следует, что одним из способов уменьшения предела разрешения является уменьшение длины волны света. В связи с этим применяется ультрафиолетовый микроскоп, в котором микрообъекты исследуются в УФ-свете. В нём используется оптика прозрачная для УФ-лучей (кварцевая оптика), а для фиксации изображения фотопластинка, люминесцентные экраны или электронно-оптические преобразователи.

Другой способ уменьшения предела разрешения – это увеличение числовой апертуры. Её можно увеличить, увеличив апертурный угол. Это можно сделать, приближая предмет к объективу. Однако расстояние предмета от линзы объектива не может изменяться произвольно, оно постоянно для каждого объектива.

Числовая апертура может быть увеличена с помощью специальной жидкой среды – иммерсии в пространстве между объективом и покровным стеклом микроскопа. В иммерсионных системах по сравнению с «сухими» системами получают большую числовую апертуру. В качестве иммерсионной среды используют воду (n=1,333), кедровое масло (n=1,515), монобромнафталин (n=1,66). При иммерсии свет от предмета до объектива проходит по оптически однородной среде и не даёт потерь на отражение. Это значительно повышает яркость изображения, что имеет весьма существенное значение, особенно для микроскопа с большим увеличением. В современных микроскопах апертурный угол может иметь наибольшее значение 70⁰. В этом случае предел разрешения оптического микроскопа 0,2 – 0,3 мкм.

Оценим полезное увеличение оптического микроскопа.

Если предмет имеет размер, равный пределу разрешения Z, а размер его изображения и, если его изображение расположено на расстоянии наилучшего зрения от глаз, то увеличение микроскопа:

.

Это увеличение называется полезным увеличением микроскопа.

Так как , то . Увеличение микроскопа названо полезным, потому что при нём глаз человека различает все элементы структуры объекта, которые разрешимы микроскопом.

 

3. Некоторые специальные приёмы оптической микроскопии.

а) Измерение размеров микроскопических объектов.

Определение величины микроскопических объектов выполняется с помощью окулярного М_ОК (рис.5а) и объектного М_ОБ (рис.5б) микрометров, представляющих из себя стеклянные пластины с нанесёнными на них масштабными шкалами. Окулярный микрометр устанавливается в плоскости промежуточного изображения, полученного от объектива. В окуляр наблюдается изображение шкалы, совмещённое с изображением микроскопируемого объекта.

Если известна цена деления шкалы окулярного микрометра, можно определить размер этого изображения, даваемого объективом, а разделив полученную величину на известное увеличение объектива – действительные размеры объекта.

Если цена деления окулярного микрометра неизвестна, то её можно определить с помощью объектного микрометра М_ОБ с известной ценой деления (обычно – 0,01 мм). Объектный микрометр помещают на место предмета. В окуляр наблюдают совмещённые изображения обоих шкал и определяют цену деления окулярного микрометра.

б) Микропроекция и микрофотография.

В оптическом микроскопе получается мнимое изображение благодаря тому, что промежуточное действительное изображение, образуемое объективом, располагается между передним фокусом F_ОК и окуляром. Если придвинуть окуляр так, чтобы изображение, которое даёт объектив, оказалось бы перед передним фокусом окуляра (рис.6), то последний будет давать действительное изображение, которое может быть спроектировано на экран или фотопластинку. Окуляр в этом случае служит проекционной линзой. Можно удалить окуляр и проектировать на экран или фотопластинку действительное изображение, даваемое только объективом, хотя при этом увеличение будут меньшим.

Наблюдение на экране действительного изображения предметов, полученного одним из указанных способов, называется микропроекцией. Фотографирование полученного таким способом действительного изображения называется микрофотографией. Обычно для этого используется специальная фотонасадка к микроскопу, которая представляет собой фотокамеру, надеваемую на окулярный конец тубуса микроскопа. Изображение предмета проектируется на плоскость расположения фотопластинки. Фотонасадка снабжена визуальной трубкой для наблюдения за изображением в процессе съёмки.

Линейное увеличение микрофотонасадки к микроскопу определяется по формуле: , где х – расстояние в мм от окуляра микроскопа до фотопластинки; 250 – расстояние наилучшего зрения в мм. n_ОБ и n_ОК – увеличение объектива и окуляра.

в) Фазово-контрастный метод.

При прохождении световой волны через прозрачный объект интенсивность света почти не изменяется, но фазы претерпевают изменения, которые зависят от толщины объекта и его показателя преломления. Увидеть детали таких объектов обычным способом практически невозможно. Фазаво-контрастный метод применяется для наблюдения малоконтрастных объектов и основан на использовании разности фаз, которая образуется при прохождении света через различные структуры (участки) исследуемого объекта.

Допустим, что в однородной прозрачной среде объекта с показателем преломления n имеется прозрачное включение М с показателем преломления n₁, вызывающее дифракцию световых лучей (рис.7). При освещении объекта параллельным пучком лучей, часть его пройдёт через среду, сойдётся в небольшом участке фокальной плоскости F объектива, а затем попадут на экран распадающимся пучком. Лучи же, образовавшиеся вследствие дифракции света на неоднородности объекта, падают на объектив в виде расходящегося пучка и после объектива не пройдут через его фокус, а сойдутся на экране в некоторой точке , являющейся изображением включения М. Между лучами, падающими на препарат параллельно, и лучами, дифрагируемыми на неоднородности М, будет некоторая разность хода, которая увеличивается с помощью оптического устройства, называемого фазовой пластинкой, до половины длины волны (). Вследствие этого в точке прямые и дифрагирующие лучи интерферируют и взаимно гасят друг друга. Поэтому изображение включения М наблюдается затемнённым на светлом фоне окружающей его среды. Фазовая пластинка Ф представляет собой слой прозрачного вещества определённой толщины с определённым показателем преломления. Пластинка имеет форму кружка очень малого диаметра и устанавливается в фокусе объектива. Через неё проходят только лучи, которые падали на препарат параллельным пучком. Они получают при этом дополнительную разность хода по отношению к лучам, дифрагируемым на неоднородности М. Для фазово-контрастной микроскопии применяют особые объективы, содержащие фазовую пластинку и специальные конденсоры, которые устанавливаются в обычном биологическом микроскопе.

 

4. Волновые свойства частиц. Электронная микроскопия.

 

Первым шагом в создании квантовой механики явилось обнаружение волновых свойств микрочастиц.

Французский физик Луи де Бройль в 1924 году пришёл к выводу, что любая движущаяся частица вещества, как и квант излучения, обладает не только корпускулярными свойствами, но и волновыми, которые можно охарактеризовать, сопоставляя частице некоторую волну, длина которой связана с импульсом p частицы таким же соотношением, как и для фотона, т.е.: ,

где m – масса частицы; - её скорость; h – постоянная Планка.

Эту волну называют волной де Бройля. Она характеризует волновые свойства движущейся частицы. Длина волны де Бройля весьма мала. Для электрона при =10⁸ м/с она имеет порядок 7А (7×10^{-10 см), т.е. соответствует длине рентгеновского излучения. Гипотеза де Бройля была столь необычной, что многие крупные физики не придали ей какого-либо значения, однако несколькими годами позже наличие у движущихся частиц волновых свойств было подтверждено экспериментально. В 1927 г. К.Дэвисон и Л.Джермер наблюдали на монокристалле никеля дифракцию электронов.}

В более поздних опытах была обнаружена дифракция при пропускании пучка электронов с высокой энергией через металлическую фольгу (поликристаллическое тело). Электроны рассеиваются на фольге и на фотопластине или флуоресцирующем экране образуется дифракционная картина, состоящая из ряда концентрических темных и светлых колец (рис.8). Подобная картина получается при прохождении через такую же фольгу пучка рентгеновских лучей.

Волновые свойства частиц можно использовать для получения увеличенных изображений предмета. Из сказанного раннее следует, что предел разрешения оптического микроскопа, в основном, определяется значением длины волны. Уменьшить предел разрешения позволяет электронный микроскоп, в котором носителем информации о предмете является поток электронов, которые, пройдя через вещество, будут рассеиваться по различным направлениям. Найдём зависимость длины волны де Бройля электронов от ускоряющего напряженя:

откуда , но , тогда .

Из формулы видно, что l зависит от ускоряющего напряжения (остальные величины являются постоянными). Подставив в формулу предела разрешения оптического микроскопа длину волны де Бройля для электронов, получим для электронного микроскопа: .

Характер рассеивания электронов зависит от структуры слоя вещества, через которые они проходят. Объекты исследования обычно приготовляются в виде плёнок, ультратонких срезов и размещаются на специальных рамках или сетках из тончайшей проволочки, а также плёнках-подложках, не имеющих собственной структуры. Для работы с электронным микроскопом пригодны очень тонкие объекты (5-100нм), потому что электроны сильно поглощаются и рассеиваются веществом.

Изображение, которое получается на экране или фотопластинке, отобразит структуру объекта. При этом оно может быть значительно увеличено по сравнению с предметом.

Основное различие оптического и электронного микроскопов состоит в том, что с объектом взаимодействуют не лучи света, а пучок быстрых электронов. Поэтому вместо системы оптических линз в электронном микроскопе движением электронного пучка управляют магнитные или электрические поля (магнитные или электрические линзы). Такие поля получают с помощью катушки с током или системы заряженных электродов. Магнитные линзы более часто употребляются, так как дают меньше искажений. На рис.9 схематически показана электронно-оптическая система простейшего электронного микроскопа с магнитными линзами.

Пучок быстрых электронов из электронной пушки (1) попадает в конденсорную линзу (2), направляющую пучок нужного сечения на исследуемый объект (3). За счёт различной степени рассеяния электронов разными участками объекта, отличающимися толщиной, плотностью или химическим составом, пучок проходящих через объект электронов несёт на себе информацию об этом объекте. Объектная линза (4) даёт промежуточное (увеличенное в несколько раз) изображение (5) объекта. Проекционная линза (6) образует конечное изображение (7), которое регистрируется фотографическим способом, либо наблюдается визуально на люминесцентном экране в специальное смотровое стекло. Все эти узлы соединены друг с другом, образуя колонку микроскопа, внутри которой поддерживается низкое давление (10^-2-10^-3 Па). Рабочее напряжение для разгона электронов достигает 50-100 кВ. Максимальное увеличение Г микроскопа, имеющего кроме конденсора и объектива, только одну проекционную линзу, определяется фокусным расстоянием f₁ и f₂ объектной и проекционной линз и расстоянию L между объектом и плоскостью конечного изображения: . Обычно величины f₁ и f₂ составляют несколько миллиметров, а L равно 1-2 м. Полезное увеличение микроскопов достигает 10⁶, а предел разрешения Z»0,1 нм, что в сотни раз лучше, чем у оптического микроскопа. Следует отметить, что применение ускоряющего напряжения, большего 100 кВ, хотя и повышает разрешающую способность микроскопа, но связано с разрушением исследуемого объекта электронами, имеющими большую скорость.

Изображение в электронном микроскопе может формироваться за счёт прохождения электронов сквозь объект и в этом случае микроскоп называется просвечивающим, если же изображение образуется отражёнными от объекта электронами, то микроскоп называется отражательным. Для биологических исследований используются, в основном, просвечивающие микроскопы.

С помощью электронного микроскопа получены уникальные снимки различных клеток, субклеточных структур, вирусов, бактерий. Можно наблюдать крупные органические молекулы (например, РНК при увеличении в 10⁵ раз). Электронная микроскопия позволяет изучать строение клеточных мембран, нервных волокон. С помощью электронного микроскопа впервые был увиден ген. Используемый отечественный микроскоп ЭВМ-100-ЛМ даёт максимальное 600000-кратное увеличение и предел разрешения порядка 3×10^-10м (0,3 нм).

 

5. Волоконная оптика и её применение в эндоскопии.

 

В начале 50-х годов прошлого столетия в различные отрасли науки и, особенно в медицину, стали внедряться волоконно-оптические элементы, которые способны передавать свет по каналам, называемыми светопроводами.

Волоконной оптикой называется раздел оптики, в котором рассматривается передача света и изображения по светопроводам.

Волоконная оптика основана на явлении полного внутреннего отражения. Свет, попадая внутрь прозрачного волокна (или стержня), окружённого веществом с меньшим показателем преломления, многократно отражается и распространяется вдоль этого волокна (рис.10). Так как при полном внутреннем отражении коэффициент отражения сравнительно высок (К=0,9999), то потери энергии в волокне, в основном, обусловлены поглощением света внутри волокна. Так, например, в волокне 1 м в видимой области спектра теряется от 30 до 70% энергии светового пучка. Для передачи больших световых потоков и сохранения гибкости светопровода отдельные волокна собираются в пучки (жгуты) – световоды, которые в медицине используются для решения двух задач: 1) передачи световой энергии для освещения холодным светом внутренних полостей; 2) для передачи изображения.

Для решения первой задачи не имеет значения относительное положение отдельных волокон. Во втором случае очень важно, чтобы расположение волокон в жгуте на входе и выходе было одинаковым, так как в противном случае изображение будет искажено. Волоконная оптика позволила модернизировать существующий раннее медицинский прибор – эндоскоп – специальный прибор для осмотра внутренних полостей (желудок, прямая кишка, бронхи и др.), который состоит из двух частей: источника света и смотровой части, содержащей систему линз. Источник света (миниатюрная лампочка) помещён на конце эндоскопа, который вводится внутрь. Используя волоконную оптику, удалось, во-первых, свет от лампочки передать внутрь органа по световоду и тем самым избегать нежелательного нагревания этого органа, которое возникает при помещении источника света внутрь полости в эндоскопе старой конструкции; во-вторых, гибкость волоконно-оптической системы такого эндоскопа допускает осмотр большей части полостей тела человека, чем жёсткие эндоскопы. Гибкий световод состоит из нескольких десятков тысяч стеклянных нитей в общей защитной оболочке.

Волоконный эндоскоп позволяет не только визуально осмотреть желудок, но и произвести необходимые фотоснимки с целью диагностики. С помощью световодов можно предать лазерное излучение во внутренние органы с целью лечебного воздействия на опухоли.

ЛЕКЦИЯ №24