МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ 5 страница
1. По истечении срока наблюдения не менее 25% клеточных культур проверяют на наличие феномена гемадсорбции. Для этого культуральную жидкость сливают, клеточный монослой отмывают раствором Хенкса или 0,85%-ным раствором натрия хлорида, имеющим температуру 20 - 25 °С, и в матрасы с культурой вносят 0,25%-ную взвесь эритроцитов морской свинки в 0,85%-ном растворе натрия хлорида в объеме, достаточном для того, чтобы покрыть весь клеточный монослой. После инкубации в течение 30 мин. при температуре (4 +/- 1) °С и последующей инкубации 30 мин. при 20 - 25 °С взвесь эритроцитов сливают, клеточный монослой трижды отмывают раствором Хенкса или 0,85%-ным раствором натрия хлорида, имеющим температуру 20 - 25 °С, и просматривают под микроскопом на наличие гемадсорбции (увеличение 70X). 2. Из всех матрасов с культурами отбирают пробы культуральной жидкости пипеткой, вместимостью 10 мл (если на протяжении срока инкубации контрольных культур производят сливы вируссодержащей жидкости из производственных культур, то в те же сроки берут пробы культуральной жидкости из матрасов с контрольными культурами и сохраняют их в замороженном состоянии). Все пробы культуральной жидкости объединяют (сливая равные объемы пипеткой, вместимостью 10 мл) и вводят из расчета одна часть контролируемой смеси проб (не менее 10 мл на каждую клеточную культуру) на 4 части питательной среды в три различные клеточные культуры: гомологичную культуру другой партии; культуру клеток человека; клеточную культуру, наиболее чувствительную для выявления вирусов - возможных контаминантов испытуемой культуры-продуцента. От каждой клеточной культуры оставляют по одному контрольному незараженному флакону. Все культуры выдерживают при температуре (36 +/- 1) °С в течение 14 сут. с однократной сменой среды через 4 - 6 сут. после инокуляции и просматривают под микроскопом на наличие цитопатических изменений (увеличение 70X). По окончании срока наблюдения культуры проверяют на наличие феномена гемадсорбции с эритроцитами морской свинки, как указано выше. Пробы считают прошедшими контроль, если в опытных и контрольных культурах отсутствуют цитопатические изменения и гемадсорбция. При наличии цитопатических изменений и (или) гемадсорбции в контрольных культурах опыт следует повторить в клеточной культуре другой партии. Если при исследовании контрольных клеточных культур в одном из испытаний обнаружены цитопатические изменения или феномен гемадсорбции, вирус, полученный в соответствующих зараженных культурах, не должен быть использован для производства вакцины. 11.1.2. Контроль вируссодержащего материала Контролю подлежит объединенный вирусный сбор, полученный в процессе приготовления вакцинного штамма, посевного вируса и вакцины. Контроль проводят в клеточных культурах, на животных и куриных эмбрионах. Если контроль осуществляют не позднее чем через 24 ч после отбора проб вируссодержащей жидкости, то последние до проведения контроля хранят при температуре (4 +/- 1) °С. При проведении контроля в более поздние сроки пробы замораживают и хранят при температуре, не превышающей -20 °С. Оттаивание материала разрешается проводить не более одного раза. 11.1.3. Контроль в клеточных культурах Испытуемый материал (не менее 50 мл на каждую клеточную культуру, если в частной фармакопейной статье нет других указаний) смешивают с иммунной сывороткой, взятой в количестве, достаточном для полной нейтрализации содержащегося в пробе вируса. Для получения иммунных сывороток используют животных, ткани которых не применяют для приготовления клеточных культур. Антиген для иммунизации животных готовят в клеточных культурах, не используемых для проведения контроля. Промежуток времени между извлечением испытуемого образца из холодильника (в случае хранения его при температуре (4 +/- 1) °С) или его размораживанием и добавлением иммунной сыворотки не должен превышать 30 мин. Смесь выдерживают при заданной температуре в течение необходимого для нейтрализации данного вируса времени, после чего вносят в матрасы с тремя указанными выше видами культур клеток. Для каждого вида культуры клеток оставляют один контрольный незараженный флакон. Культуры выдерживают при температуре (36 +/- 1) °С 14 сут. со сменой среды на 4 - 6 сут., просматривая под микроскопом на наличие цитопатических изменений. По истечении 14 сут. опытные и контрольные клеточные культуры замораживают, оттаивают и производят пассаж на одноименной культуре, внося в нее не менее 25 мл неосветленной культуральной жидкости. Разведение вносимого материала поддерживающей средой не должно превышать 1:4. В случае, если контроль производится в перевиваемой клеточной линии, по истечении указанного срока инкубации возможен субпассаж клеток. Культуры клеток (опытную и контрольную) выдерживают при температуре (36 +/- 1) °С 14 сут. со сменой среды на 4 - 6 сут., просматривая под микроскопом на наличие цитопатических изменений. По истечении срока наблюдения культуры проверяют в реакции гемадсорбции, как указано выше. Материал считают прошедшим контроль, если в опытных и контрольных культурах отсутствуют цитопатические изменения и гемадсорбция. При наличии цитопатических изменений и (или) гемадсорбции в контрольных культурах опыт повторяют на другой партии клеточной культуры. 11.2. Контроль на животных Используют здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. В случае, если содержащийся в контролируемом материале вакцинный вирус патогенен для животных, используемых при контроле, его предварительно нейтрализуют иммунной сывороткой. 11.2.1. Контроль на взрослых мышах Используют не менее 20 мышей, массой 15 - 20 г. Каждому животному вводят по 0,03 мл испытуемого материала интрацеребрально и по 0,5 мл интраперитонеально. Материал вводят шприцем, вместимостью 1 мл (здесь и далее погрешность объема дозы не более 4%). Животных наблюдают 28 сут. Все мыши, которые погибают позднее первых 24 ч после введения материала, а также животные с видимыми признаками заболевания должны быть вскрыты и исследованы макроскопически на наличие признаков патологии, не связанной с введением препарата. При отсутствии последней из внутренних органов (печень, почки, селезенка, легкие) и головного мозга готовят 10%-ные суспензии на 0,85%-ном растворе хлорида натрия и вводят их не менее чем 5 мышам интрацеребрально и интраперитонеально в дозах, указанных выше. Животных наблюдают 21 сут. Материал считается прошедшим контроль, если на протяжении периода наблюдения остаются здоровыми не менее 80% инокулированных в первом и втором случае животных и ни у одного из них не выявляют признаков, указывающих на присутствие в вакцине каких-либо посторонних агентов. 11.2.2. Контроль на новорожденных мышах Используют не менее 20 новорожденных мышей не старше 24 ч. Каждому животному вводят по 0,01 мл испытуемого материала интрацеребрально и по 0,1 мл интраперитонеально. Животных наблюдают 14 сут. Все мыши, которые погибают через 24 ч после введения материала или у которых наблюдают признаки заболевания, должны быть вскрыты и исследованы макроскопически на наличие спонтанной патологии, не связанной с введением препарата. При отсутствии последней из внутренних органов (печень, почка, селезенка, легкие) и головного мозга готовят 10%-ные суспензии на 0,85%-ном растворе натрия хлорида и вводят их не менее чем 5 новорожденным мышам интрацеребрально и интраперитонеально в дозах, указанных выше. Животных наблюдают 14 сут. Материал считается прошедшим контроль, если на протяжении периода наблюдения остаются здоровыми не менее 80% инокулированных в первом и втором случае животных и ни у одного не выявляется признаков, указывающих на присутствие в вакцине каких-либо посторонних агентов. 11.2.3. Контроль на морских свинках Используют не менее 5 морских свинок, массой 300 - 350 г. Каждому животному вводят по 0,1 мл испытуемого материала интрацеребрально и по 5,0 мл интраперитонеально. Животных наблюдают 42 сут. Все животные, которые погибают позднее первых 24 ч после введения материала или у которых наблюдаются признаки заболевания, должны быть вскрыты и исследованы макроскопически на наличие признаков вирусной или туберкулезной инфекции. Внутренние органы (селезенка, почка, легкое, печень, сальник) и лимфоузлы (паховые, подмышечные, забрюшинные, трахеобронхиальные, портальные) должны быть исследованы макроскопически, а 10%-ные суспензии на 0,85%-ном растворе хлорида натрия этих органов и лимфоузлов исследуют путем посева на среду Левенштейна. В конце периода наблюдения всех выживших животных вскрывают и исследуют макроскопически на наличие признаков вирусной или туберкулезной инфекции. Материал считают прошедшим контроль, если не менее 80% инокулированных животных остаются здоровыми к концу периода наблюдения и ни у одного из них не наблюдается признаков вирусной или туберкулезной инфекции и результаты посева отрицательны. 11.2.4. Контроль на куриных эмбрионах В случае, если содержащийся в контролируемом материале вирус патогенен для куриных эмбрионов, его необходимо предварительно нейтрализовать иммунной сывороткой. Испытуемый материал вводят трем группам куриных эмбрионов по 10 штук в каждой группе. Первой группе куриных эмбрионов 9 - 10-дневного возраста материал вводят по 0,25 мл в аллантоисную полость. Эмбрионы инкубируют при температуре (36 +/- 1) °С 5 - 6 сут. По истечении указанного срока аллантоисную жидкость проверяют в реакции гемагглютинации с эритроцитами морской свинки и петуха. При этом в лунках агглютинационных досок готовят 5 - 6 последовательных двукратных разведений (на 0,85%-ном растворе натрия хлорида) аллантоисной жидкости из каждого инокулированного эмбриона. Затем в лунки добавляют равные объемы 0,5% суспензии (на 0,85%-ном растворе натрия хлорида) эритроцитов. После 30 - 40 мин. выдерживания при температуре 20 - 25 °С учитывают результаты. Материал считают прошедшим контроль, если в течение указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80% инокулированных эмбрионов и при отрицательной реакции гемагглютинации во всех случаях. Второй группе куриных эмбрионов 7 - 8-дневного возраста материал вводят по 0,25 мл в желточный мешок. Эмбрионы выдерживают при температуре (37 +/- 1) °С 10 сут. Материал считается прошедшим контроль, если к концу указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80% инокулированных эмбрионов. Третьей группе куриных эмбрионов 10 - 11-дневного возраста материал вводят по 0,2 мл на хорионаллантоисную оболочку с боковой поверхности яйца через искусственную воздушную полость или со стороны естественного воздушного мешка. Эмбрионы инкубируют при (37 +/- 1) °С в течение 5 - 6 сут. По истечении указанного срока оболочки извлекают и просматривают. Материал считается прошедшим контроль, если к концу указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80% инокулированных эмбрионов и на хорионаллантоисных оболочках всех эмбрионов отсутствуют изменения, видимые невооруженным взглядом. 11.3. Контроль на отсутствие микоплазм Контролю подлежат: культуральная жидкость контрольных клеточных культур, объединенный вирусный сбор, полученный в процессе приготовления вакцинного штамма, посевного вируса и вакцины, а также готовые формы живых и инактивированных вирусных вакцин. Применяют питательную среду следующего состава: г/л триптический гидролизат бычьего сердца - 20,0 мясной экстракт - 13,0 экстракт хлебопекарных дрожжей - 1,5 хлорид натрия - 5,0 агар - 3,0. pH 7,8 (после стерилизации) Приготовление 1 л среды (взвешивание производят с погрешностью не более 0,01 г): К гидролизату бычьего сердца в количестве 200 мл (с содержанием сухих веществ 8 - 10%) добавляют 400 мл мясного экстракта 1:2 с содержанием сухих веществ 3,0 - 3,5% и экстракт дрожжей из расчета 1,5 г сухих веществ на 1 л среды, а также 5,0 г хлорида натрия и 3,0 г агара. С помощью 10%-ного раствора NaOH устанавливают значение pH, равное 7,8 - 8,0. Среду нагревают до расплавления агара в водяной бане, фильтруют при необходимости, разливают и стерилизуют при 50 кПа (0,5 кгс/кв. см) 30 мин. Перед употреблением среду разогревают в водяной бане до полного расплавления агара, охлаждают до 40 - 45 °С, добавляют 15 - 20% сыворотки лошади (без консерванта) и 100 ед./мл пенициллина и разливают по 10 мл в пробирки. Каждую серию среды проверяют на чувствительность к микоплазмам, используя тест-штаммы микоплазм Mycoplasma arginini G230 (ОСО 42-28-105-87). Подлежащий контролю материал вносят по 0,5 мл в каждую пробирку со средой. Посев производят пипеткой, вместимостью 1 мл, столбиком от дна пробирки. Пробирки выдерживают 14 сут. при температуре (37 +/- 1) °С. Просмотр пробирок проводят на 3, 7, 10 и 14 сут. При наличии роста микоплазм хотя бы в одной пробирке материал бракуют. 11.4. Контроль на отсутствие микобактерий Вакцинный препарат не должен содержать микобактерий птичьего вида, источником которых может быть вакцинный субстрат (культура клеток перепелиных эмбрионов), и микобактерий туберкулеза, источником которых может быть сыворотка крупного рогатого скота (СКРС). 11.4.1. Контроль на отсутствие микобактерий птичьего вида Контролируют сливы с контрольных (не зараженных вирусом) матрацев с культурой клеток перепелиных эмбрионов. Контроль на отсутствие микобактерий птичьего вида проводят путем высева исследуемого материала на среду Левенштейна - Йенсена. 20 мл исследуемого материала центрифугируют в течение 15 мин. при (3500 +/- 500) об./мин. 19 мл надосадочной жидкости удаляют, а осадок ресуспендируют в оставшемся 1 мл и высевают по 0,2 мл на 5 пробирок со средой Левенштейна - Йенсена. Учет производят через 30 сут. экспозиции при температуре (38 +/- 1) °С. На поверхности среды не должно быть колоний микобактерий. 11.4.2. Контроль на отсутствие микобактерий туберкулеза Контролируют каждую серию СКРС. Контроль проводят на морских свинках. 20 мл СКРС центрифугируют 15 мин. при (3500 +/- 500) об./мин., 19 мл надосадочной жидкости удаляют. Осадок ресуспендируют в оставшемся 1 мл сыворотки и вводят по 0,5 мл в/б двум морским свинкам, массой (325 +/- 25) г. Животных наблюдают в течение 42 сут. Морские свинки должны оставаться здоровыми и не иметь признаков туберкулезной интоксикации (потеря массы тела). Через 42 сут. животных вскрывают и проводят макроскопическое, гистологическое и бактериологическое исследование внутренних органов: селезенки, легких, печени, сальника, брюшины, лимфатических узлов (паховых, подмышечных, забрюшинных, трахеобронхиальных, портальных, брыжеечных). Животные, павшие или заболевшие в течение срока наблюдения, тоже подлежат обязательному вскрытию и исследованию. Макроскопически не должно быть во внутренних органах туберкулезных поражений (специфических узелков), в лимфатических узлах не должно быть фиброзно-казеозных изменений. При гистологическом исследовании не должно быть специфических туберкулезных поражений. При бактериологическом исследовании не должно быть роста микобактерий на поверхности среды Левенштейна - Йенсена через 45 суток инкубации при температуре (38 +/- 1) °С. Проведение бактериологических исследований В отдельных фарфоровых ступках тщательно растирают лимфатические узлы (все вместе), часть селезенки, 1/4 весовую часть печени и одно легкое, обрабатывают 5%-ным раствором серной кислоты в течение (10 +/- 1) мин., центрифугируют при (3000 +/- 500) об./мин. в течение (15 +/- 5) мин. (общее время воздействия серной кислоты не должно превышать 25 мин.). Сливают супернатант и ресуспендируют осадок в 5 - 6 мл стерильного 0,9%-ного раствора натрия хлорида и засевают на яичную среду Левенштейна - Йенсена. Для посева каждого органа используется не менее 5-ти пробирок. Посевы выдерживают 45 сут. при температуре (38 +/- 1) °С. Приготовление среды Левенштейна - Йенсена Для определения свежести яиц используют 7%-ный и 3%-ный раствор поваренной соли. Яйца, тонущие в 7%-ном растворе, - вполне свежие; яйца, плавающие в 3%-ном растворе, - не пригодны для изготовления питательных сред. Свежие яйца (1 л - 20 - 22 шт.) тщательно моют мылом и щеткой, затем протирают 70° спиртом. На обоих концах делают отверстия стерильным пинцетом и содержимое яйца выливают в стерильную литровую банку с бусами. Эту массу перемешивают энергичным встряхиванием и добавляют 20 мл 2%-ной малахитовой зелени и фильтруют через стерильную марлю. Затем добавляют солевой раствор (см. пропись ниже) в количестве 600 мл с 30 г картофельного крахмала. Среду смешивают, разливают в 20 мл пробирки БЦЖ (ТУ 115-15-63) по 6 мл, скашивают под углом 30 - 40 °С и помещают в аппарат для свертывания при (85 +/- 1) °С на 40 минут. Для проверки стерильности среду ставят на 2 сут. в термостат при температуре (37 +/- 1) °С.
Таблица 5
СОЛЕВОЙ РАСТВОР ДЛЯ СРЕДЫ ЛЕВЕНШТЕЙНА - ЙЕНСЕНА
30 г крахмала растворить в солевом растворе, разлить в колбы примерно по 150 мл. Поставить в водяную баню и кипятить до загустения (постоянно перемешивая). Затем стерилизовать при 110 °С в течение 30 мин.
12. Контроль качества герметизации ампул и флаконов с медицинскими иммунобиологическими препаратами
Настоящая методика используется для контроля качества герметизации ампул и флаконов с медицинскими иммунобиологическими препаратами (МИБП), герметизированными при пониженном давлении ("под вакуумом") или после заполнения их защитным газом при атмосферном давлении. При контроле качества герметизации ампул и флаконов с МИБП под вакуумом определяющим параметром является давление воздуха в ампулах и флаконах. Диапазон измеряемых величин - от 10 Па до 100 кПа. Допустимыми величинами являются давления порядка 10 Па - 1 кПа. Метод измерения - визуальное определение цвета свечения газовой среды ампул и флаконов с МИБП при возбуждении ее высокочастотным электрическим полем с помощью аппаратов типа д'Арсонваль или Тесла. Частота электрических колебаний колеблется от 20 до 50 кГц, напряжение - от 15 до 20 кВ. В зависимости от величины давления (глубины вакуума) цвет свечения будет различным. Общепринятой является следующая приближенная зависимость цвета свечения от величины давления:
Таблица 6
ЗАВИСИМОСТЬ ЦВЕТА СВЕЧЕНИЯ ОТ ВЕЛИЧИНЫ ДАВЛЕНИЯ
При работе следует соблюдать технику безопасности по эксплуатации источников высокочастотных электрических сигналов. Оператор должен пройти обучение работе с используемым аппаратом д'Арсонваля или Тесла и выполнять требования техники безопасности. Оператор должен иметь медицинскую справку об отсутствии дальтонизма. Условия измерения нормальные, по ГОСТу 395-80. Контролю на наличие вакуума подвергаются все ампулы и флаконы серии. Перед началом испытаний следует убедиться, что ампулы и флаконы приняли температуру в соответствии с ГОСТом 395-80. Это особенно важно, если перед проведением испытаний ампулы и флаконы хранились при пониженной температуре. Выполнение измерений проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации используемого источника высокочастотных электрических полей. Не следует прикасаться высокочастотным электродом к месту запайки ампул. Определение величины давления проводят в соответствии с вышеприведенной таблицей. Требования к величине давления (глубине вакуума) регламентируются частными фармакопейными статьями. Контроль точности определения следует проводить по свечению образцов ампул и флаконов, герметизированных в строго контролируемых условиях при точно известных величинах давления (стандартные образцы предприятий - СТП). При контроле качества герметизации ампул и флаконов с МИБП, герметизированных после заполнения защитным газом при атмосферном давлении, испытанию подлежат все ампулы серии. Контроль флаконов __ осуществляют выборочно, объем выборки составляет 0,5 \/N, где N - число флаконов в серии. При обнаружении в выборке хотя бы одного негерметичного флакона проводят контроль всех флаконов серии. Для проведения испытаний ампулы и флаконы помещают в кассеты, которые погружают в емкость, заполненную водой, подкрашенной любым водно-растворимым красителем (например, метиленовая синь). Кассеты погружают таким образом, чтобы ампулы и флаконы полностью находились в воде. Емкость герметически закрывают и создают в ней избыточное, по сравнению с атмосферным, давление (100 +/- 20) кПа. Это давление выдерживают в течение 20 - 25 мин., после чего устанавливают в емкости давление, равное атмосферному. Емкость открывают, кассеты с ампулами и флаконами вынимают и просматривают на наличие в них подкрашенной воды. Ампулы и флаконы, содержащие подкрашенную воду, бракуют. При работе необходимо соблюдать требования техники безопасности по эксплуатации сосудов, находящихся под повышенным давлением.
13. Определение остаточного кислорода в ампулах и флаконах с МИБП, герметизированных после заполнения защитным газом
Настоящая методика используется для определения величины остаточного кислорода в ампулах и флаконах с медицинскими иммунобиологическими препаратами (МИБП), герметизированных после заполнения их защитным газом, не содержащим кислород (азот, аргон и др.). Концентрация кислорода в составе защитных газов, содержащихся в ампулах и флаконах с МИБП, регламентируется частными фармакопейными статьями, но во всех случаях она не должна превышать 2% (по объему). За величину концентрации кислорода принимают среднюю арифметическую величину концентрации, полученную из данных всех испытанных образцов. При этом ни в одной ампуле или флаконе концентрация кислорода не должна превышать сумму средней арифметической и утроенной среднеквадратичной ошибки результатов отдельных измерений. Измерительные устройства, используемые для данного испытания, должны определять кислород в диапазоне концентраций 0,05 - 25%, при этом класс точности должен составлять 10,0 от измеряемой величины. Минимальный объем пробы газа, предназначенный для анализа, должен быть не более 1 куб. см. В качестве таких средств измерений могут быть использованы различные газоанализаторы, отвечающие вышеперечисленным требованиям, например газовый хроматограф типа ЛХМ-8МД, масс-спектрометры, полярографы. Используемые газоанализаторы должны быть аттестованы и поверены. При проведении испытаний следует соблюдать технику безопасности в соответствии с инструкцией предприятий, определяющей безопасность работы с МИБП, со стеклом, а также инструкцией по технике безопасности при работе с соответствующим типом газоанализатора. Оператор, выполняющий данный вид испытаний, должен пройти обучение работе на газоанализаторе и технике безопасности в соответствии с вышеприведенными требованиями. Измерения проводят при нормальных условиях по ГОСТу 395-80. Подготовку к выполнению измерений, отбор проб газа для анализа из ампул и флаконов и выполнение измерений проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации используемого газоанализатора. Следует принять все меры предосторожности, чтобы в анализируемую пробу не попал газ из окружающей среды. Контроль содержания кислорода осуществляют в каждой серии препарата. Ампулы или флаконы с МИБП от каждой серии отбирают __ выборочно, объем выборки составляет 0,2 \/N, где N - число образцов в контролируемой серии. Порядок отбора образцов зависит от способа герметизации: при машинном способе герметизации следует отбирать образцы из числа последних в каждой кассете; при ручном способе герметизации отбор образцов следует осуществлять равномерно в процессе герметизации (в начале, середине и конце) от каждого оператора, производящего герметизацию. Вычисление результатов измерений проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации используемого газоанализатора.
14. Определение белкового азота с реактивом Несслера
Метод основан на свойстве реактива Несслера давать цветную реакцию с ионами аммония, образующимися после минерализации белковых продуктов. 14.1. Метод с использованием трихлоруксусной кислоты Рекомендован для определения белкового азота в вирусных вакцинах, анатоксинах и инфекционных аллергенах. 14.1.1. Анализ препарата с содержанием белкового азота 0,01 - 0,40 мг/мл Методика определения. В центрифужную пробирку вносят пипеткой необходимый объем (А) препарата и прибавляют раствор трихлоруксусной кислоты до конечной концентрации 10%. Пробу оставляют на 18 - 20 ч при температуре 4 - 8 °С. Осадок отделяют центрифугированием при частоте вращения 2000 об./мин., температуре 4 - 6 °С в течение 30 мин., надосадочную жидкость сливают, осадок промывают 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, вновь центрифугируют в тех же условиях и удаляют надосадочную жидкость. К осадку прибавляют 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Пробирку закрывают стеклянным колпачком. Пробу минерализуют на песочной бане. Одновременно в аналогичных условиях минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Для ускорения минерализации используют пергидроль, который периодически прибавляют в предварительно охлажденную пробирку по 1 - 2 капли. Минерализацию продолжают до обесцвечивания содержимого пробирки не менее 10 ч. Объем минерализата доводят водой до 10 мл и раствор перемешивают. Для колориметрирования отбирают в пробирку необходимое количество (Б) полученного раствора, содержащее 10 - 20 мкг азота, доводят его объем водой до 9,5 мл, перемешивают, прибавляют 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. Оптическую плотность раствора определяют на фотоэлектроколориметре при длине волны 400 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольным раствором, приготовленным аналогичным образом из контрольной пробы. Содержание белкового азота в препарате в миллиграммах на 1 мл (X) вычисляют по формуле:
а x 10 а X = ------------ = -----------, А x В x 1000 А x В x 100
где: а - количество азота, рассчитанное по калибровочному графику, мкг; А - количество анализируемого препарата, мл; В - количество раствора минерализата, взятое для колориметрирования, мл. Калибровочный график. Готовят основной раствор, содержащий 0,1 мг азота в 1 мл: 0,2357 г аммония сульфата (х.ч.), доведенного до постоянной массы в эксикаторе над безводным кальция хлоридом, растворяют в мерной колбе, вместимостью 500 мл, в воде и доводят объем раствора водой до метки. Основной раствор хранят в течение 1 г при температуре 4 - 8 °С в колбе с притертой пробкой. Перед определением основной раствор разводят водой в 2 раза. Отбирают в пробирки 0,1 - 0,5 мл (5 - 25 мкг азота) полученного раствора с интервалом в 0,1 мл, доводят объем раствора водой до 9,5 мл, перемешивают, прибавляют по 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. Пробы колориметрируют, как описано выше, по сравнению с контрольным раствором, содержащим 9,5 мл воды и 0,5 мл реактива Несслера. Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе. Примечания. 1. При проведении анализа необходимо руководствоваться данными таблицы 7, в которой указаны оптимальные условия для выполнения методики в зависимости от концентрации белкового азота в анализируемом препарате.
Таблица 7
ОПТИМАЛЬНОЕ СООТНОШЕНИЕ АНАЛИЗИРУЕМОГО ПРЕПАРАТА И РЕАГЕНТОВ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ БЕЛКОВОГО АЗОТА С РЕАКТИВОМ НЕССЛЕРА
|
