Студопедия — МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ 6 страница
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ 6 страница






2. Приготовление реактива Несслера. В мерную колбу, вместимостью 100 мл, наливают воду до метки, в дальнейшем пользуются только этой водой, 10 г ртути (II) йодида растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством воды и переливают в склянку из темного стекла. Ступку ополаскивают небольшим количеством воды и сливают в ту же склянку. Прибавляют 5 г калия йодида. В оставшейся воде растворяют 20 г натрия гидроксида и после охлаждения раствора переливают его в ту же емкость. В течение нескольких дней осаждается избыток ртутных солей. Прозрачную жидкость осторожно сливают с осадка в темную склянку. Реактив хранят в темном месте.

3. Приготовление 80%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. 150 г трихлоруксусной кислоты растворяют в 100 мл воды. 1 мл полученного раствора титруют раствором натрия гидроксида концентрации 1 моль/л; индикатор - фенолфталеин.

Концентрацию трихлоруксусной кислоты в анализируемом растворе в процентах (X) рассчитывают по формуле:

 

Х = а x 0,1634 x 100 = а x 16,34,

 

где:

а - количество натрия гидроксида концентрации 1 моль/л, пошедшее на титрование испытуемой пробы, мл:

0,1634 - количество трихлоруксусной кислоты, соответствующее 1 мл раствора натрия гидроксида концентрации 1 моль/л, г.

Раствор разводят до концентрации 80%. (Растворы трихлоруксусной кислоты меньших концентраций готовят соответствующим разведением 80%-ного раствора.)

 

14.1.2. Анализ препаратов с содержанием белкового азота 2,5 - 10,0 мкг/мл

Методика определения. В центрифужную пробирку вносят 5 мл препарата, прибавляют 0,72 мл 80%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, если нет других указаний. Пробы оставляют на 18 - 20 ч при температуре 4 - 8 °С. Осадок отделяют центрифугированием при частоте вращения 2000 об./мин., температуре 4 - 6 °С в течение 30 мин., промывают 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и вновь центрифугируют в тех же условиях. К осадку прибавляют 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Пробирку закрывают стеклянным колпачком. Пробу минерализуют на песочной бане. Одновременно в аналогичных условиях минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Для ускорения минерализации используют пергидроль, который периодически прибавляют в предварительно охлажденную пробирку по 1 - 2 капле. Минерализацию продолжают до обесцвечивания содержимого пробирки, но не менее 10 ч. Объем минерализата доводят водой до 5 мл и раствор перемешивают. Для колориметрирования отбирают в пробирку 1 мл полученного раствора, доводят его объем водой до 9,5 мл, перемешивают, прибавляют 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. Оптическую плотность раствора измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 400 нм в кюветах с толщиной слоя 20 мм по сравнению с контрольным раствором, приготовленным аналогичным образом из контрольной пробы.

Содержание белкового азота в миллиграммах на 1 мл (X) вычисляют по формуле:

 

а x 5 а

X = ------------ = ----,

5 x 1 x 1000 1000

 

где:

а - количество азота, рассчитанное по калибровочному графику, мкг.

Калибровочный график. Основной раствор аммония сульфата, содержащий 0,1 мг/мл азота, полученный, как описано в разделе 14.1.1, разводят водой в 5 раз. Отбирают в пробирки от 0,1 до 0,6 мл полученного раствора (2 - 12 мкг азота) с интервалом 0,1 мл, прибавляют воду до объема 9,5 мл, перемешивают, прибавляют по 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. Пробы колориметрируют, как описано выше, по сравнению с контрольным раствором, содержащим 9,5 мл воды и 0,5 мл реактива Несслера.

Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Примечание. Приготовление реактива Несслера и раствора трихлоруксусной кислоты проводят, как указано в разделе 14.1.1.

 

14.2. Метод с использованием фосфорно-вольфрамовой кислоты

Рекомендован для определения белкового азота в неинфекционных аллергенах.

Методика определения (для препаратов с содержанием белкового азота 0,016 - 0,400 мг/мл). В центрифужную пробирку вносят пипеткой необходимое количество (А) (табл. 7, раздел 14.1.1) препарата, доводят объем до 3 мл 0,9%-ным раствором натрия хлорида, прибавляют 0,3 мл 20%-ного раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты, 0,3 мл концентрированной серной кислоты и перемешивают. Пробу оставляют на 18 - 20 ч при температуре 4 - 8 °С. Осадок отделяют центрифугированием при частоте вращения 2000 об./мин. в течение 30 мин. при температуре 4 - 6 °С, промывают его смесью, состоящей из 1 мл воды, 0,1 мл концентрированной серной кислоты, 0,1 мл 20%-ного раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты, и вновь центрифугируют в тех же условиях. К осадку прибавляют 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Пробирку закрывают стеклянным колпачком и минерализуют на песочной бане. Одновременно минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Для ускорения минерализации используют пергидроль, периодически прибавляя его по 1 - 2 капле в предварительно охлажденную пробирку. Минерализацию продолжают до образования осадка желтого цвета (не менее 10 ч), прибавляют 1 - 2 капли пергидроля и минерализуют еще 5 - 6 ч. Если цвет осадка не изменяется, то сжигание прекращают. Объем минерализата доводят водой до 10 мл, раствор тщательно перемешивают и центрифугируют при частоте вращения 2000 об./мин. в течение 30 мин. при температуре 4 - 6 °С. Надосадочную жидкость сливают в пробирки. Для колориметрирования отбирают необходимый объем надосадочной жидкости (В) и проводят анализ, как описано в разделе 14.1.1.

 

15. Определение общего азота с реактивом Несслера

 

Принцип метода аналогичен описанному в разделе 14.1.1.

Методика определения. В пробирку вносят пипеткой 0,5 мл препарата с содержанием общего азота 100 - 400 мкг и прибавляют 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Пробирку закрывают стеклянным колпачком. Пробу минерализуют на песочной бане. Параллельно минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Далее анализ проводят, как указано в разделе 14.1.1.

 

16. Определение белка с биуретовым реактивом

 

Метод основан на способности пептидной связи молекулы белка давать цветное комплексное соединение меди в щелочной среде. Метод рекомендован для определения белка в иммуноглобулинах и в антитоксических сыворотках.

Методика определения. 1 мл иммуноглобулина помещают в мерную колбу, вместимостью 50 мл, и доводят объем раствора 0,9%-ным раствором натрия хлорида до метки. К 5 мл полученного раствора прибавляют 5 мл биуретового реактива. Одновременно готовят контрольную смесь, состоящую из 5 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида и 5 мл биуретового реактива. Все пробы перемешивают и оставляют на 30 мин. Оптическую плотность раствора определяют на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольным раствором.

Содержание белка в процентах (X) вычисляют по формуле:

 

Dисп x Сст

X = ----------,

Dст

 

где:

Сст - концентрация белка стандартного раствора, %;

Dст - показатель оптической плотности стандартного раствора;

Dисп - показатель оптической плотности испытуемого раствора.

Стандартный раствор готовят из стандартного образца предприятия (СОП) путем разведения 1 мл СОП в мерной колбе, вместимостью 50 мл, стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида до метки. Стандартный раствор консервируют прибавлением мертиолята до концентрации 100 мкг/мл. Раствор пригоден к употреблению в течение месяца при температуре 4 - 8 °С.

Содержание белка в СОП определяют по отраслевому стандартному образцу (ОСО содержания белка в иммуноглобулине).

Определение содержания белка в СОП. Для определения содержания белка в СОП используют 5 ампул раствора иммуноглобулина, предназначенного для СОП, и 2 ампулы ОСО.

Из каждой ампулы берут пипеткой по 1 мл пробы и разводят 0,9%-ным раствором натрия хлорида в мерной колбе, вместимостью 50 мл, до метки. Из каждого полученного раствора СОП и ОСО отбирают 4 пробы по 5 мл и к каждой прибавляют по 5 мл биуретового реактива. Пробы перемешивают. Контролем служит смесь, состоящая из 5 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида и 5 мл биуретового реактива. Все пробы колориметрируют через 30 мин., как указано выше. Измерение оптической плотности каждой пробы проводят трижды и рассчитывают средний арифметический показатель.

Отклонение показателей оптической плотности параллельных проб должно быть в пределах +/- 2,5% от среднего арифметического значения показателя. Если отклонение не соответствует +/- 2,5%, то проводят повторное определение из тех же растворов, отобрав по 5 проб. При больших отклонениях цифровых значений в пробах следует весь анализ проводить заново, используя для этого новые ампулы ОСО и СОП.

Примечания. 1. При определении белка в антитоксических сыворотках в качестве стандартного раствора используют серию сыворотки (СОП), содержание белка в котором установлено по ОСО, приготовленному на основе сыворотки в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича.

2. Приготовление биуретового реактива. Растворяют 90 г калия-натрия виннокислого в 400 мл раствора натрия гидроксида концентрации 0,2 моль/л, прибавляют 10 г меди сульфата, после растворения соли прибавляют 10 г калия йодида и доводят объем тем же раствором натрия гидроксида до 2 л.

 

17. Определение белка по методу Лоури

 

Метод основан на свойстве ароматических аминокислот давать цветную реакцию с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи.

17.1. Метод без предварительного осаждения белка

Метод рекомендован для определения белка в химических вакцинах.

Методика определения. К 1 мл исследуемого раствора, содержащего 50 - 150 мкг белка, прибавляют 5 мл реактива С. Содержимое пробирки перемешивают и оставляют на 10 мин. при температуре 18 - 20 °С. Затем прибавляют 0,5 мл реактива Фолина и пробу оставляют на 30 мин. Оптическую плотность измеряют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при длине волны 750 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольным раствором, содержащим 1 мл растворителя, 5 мл реактива С и 0,5 мл реактива Фолина.

Содержание белка в препарате рассчитывают по калибровочному графику.

Калибровочный график. ОСО содержания белка для метода Лоури разводят в соответствии с инструкцией по применению до концентрации 200 мкг/мл. К 0,2 - 0,8 мл полученного раствора (40 - 160 мкг белка) с интервалом 0,2 мл прибавляют воду соответственно до 1 мл, далее проводят анализ, как указано выше.

Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Примечания. 1. Приготовление реактива Фолина. В круглодонную колбу, вместимостью 1 л, наливают 350 мл воды, прибавляют 50 г натрия вольфрамата и 12,5 г натрия молибдата, перемешивают до полного растворения. К полученному раствору прибавляют 25 мл 85%-ного раствора ортофосфорной кислоты, 50 мл концентрированной соляной кислоты и смесь кипятят с обратным холодильником в течение 10 ч. В остывшую смесь прибавляют 75 г лития сульфата, 25 мл воды и 3 капли бромной воды. Кипятят (без холодильника) на асбестовой сетке в течение 15 мин. для удаления избытка брома. Смесь охлаждают до температуры 18 - 20 °С и доводят объем раствора водой до 500 мл. Перемешивают и фильтруют через стеклянный фильтр N 1. Из фильтрата отбирают 1 мл в колбу, вместимостью 100 мл, прибавляют 45 - 50 мл воды и титруют раствором натрия гидроксида концентрации 0,1 моль/л (индикатор - фенолфталеин). Перед употреблением реактив Фолина разводят водой до концентрации кислоты 1 N.

2. Приготовление реактива А. 2 г натрия карбоната растворяют в растворе натрия гидроксида концентрации 0,1 моль/л и доводят объем раствора этим же раствором до 100 мл.

3. Приготовление реактива В. 0,5 г меди сульфата растворяют в 1%-ном растворе калия-натрия виннокислого и доводят объем раствора этим же раствором до 100 мл.

4. Приготовление реактива С. Перед анализом смешивают 50 мл реактива А и 1 мл реактива В.

 

17.2. Метод с предварительным осаждением белка

Метод рекомендован для препаратов, содержащих компоненты, влияющие на результаты анализа, например мертиолят, ароматические аминокислоты и т.д.

Методика определения. В центрифужную пробирку вносят 1 мл препарата, содержащего 100 - 300 мкг белка, прибавляют 1 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают. Пробу оставляют на 18 - 20 ч при температуре 4 - 8 °С. Осадок отделяют центрифугированием при частоте вращения 2000 об./мин. при температуре 5 °С в течение 30 мин., промывают 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и вновь центрифугируют в тех же условиях. Осадок растворяют в 0,2 мл раствора натрия гидроксида концентрации 0,1 моль/л, доводят объем раствора водой до 1 мл. К 0,5 мл полученного раствора, содержащего 50 - 150 мкг белка, прибавляют 0,5 мл воды, перемешивают и прибавляют 5 мл реактива С. Содержимое пробирок перемешивают и оставляют при температуре 18 - 20 °С на 10 мин. Затем прибавляют 0,5 мл реактива Фолина и перемешивают. Через 30 мин. измеряют оптическую плотность проб на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 750 нм по сравнению с контрольной пробой, содержащей 0,1 мл раствора натрия гидроксида концентрации 0,1 моль/л, 0,9 мл дистиллированной воды, 5 мл реактива С и 0,5 мл реактива Фолина. Содержание белка рассчитывают по калибровочному графику. Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Примечания. 1. Построение калибровочного графика, приготовление реактива Фолина и реактива С проводят в соответствии с разделом 17.1.

2. Приготовление 10 и 20%-ного растворов трихлоруксусной кислоты проводят в соответствии с разделом 14.1.1.

 

В целях унификации методов контроля биологических препаратов целесообразно использовать один метод для оценки химических показателей в однотипных препаратах.

В частности, для определения белка в препаратах с высоким его содержанием (9 - 15%, сыворотки, иммуноглобулины) рекомендуется метод определения белка с биуретовым реактивом, отличающийся простотой, доступностью и наименьшей погрешностью.

При низком содержании белка в препаратах (менее 0,1%), а также в присутствии других азотсодержащих компонентов целесообразно использовать методы с предварительным осаждением белка трихлоруксусной кислотой - метод с реактивом Несслера или метод Лоури.

В очищенных белковых препаратах, как правило, используется метод Лоури без предварительного осаждения белка.

 

18. Определение аминного азота формольным титрованием

 

Принцип метода основан на блокировании формальдегидом при pH 7,0 свободных аминогрупп и титровании щелочью эквивалентного количества карбоксильных групп. Начало и конец титрования определяют потенциометрически.

Методика определения. В стакан, вместимостью 50 мл, наливают необходимый объем (А) анализируемого раствора препарата, содержащего 1,5 - 5,0 мг аминного азота, и доводят общий объем дистиллированной водой до 20 мл. Электроды потенциометра погружают в исследуемый раствор, pH которого доводят до 7,0 с помощью раствора натрия гидроксида концентрации 0,1 моль/л. Во время определения электроды должны все время оставаться погруженными в раствор. К нейтрализованному раствору добавляют 2 мл нейтрального формалина (pH которого перед каждым определением доводят до 7,0 10%-ным раствором натрия гидроксида), перемешивают и, не вынимая электродов, титруют содержимое раствором натрия гидроксида концентрации 0,1 моль/л до pH 9,1. При титровании следует использовать бюретку, вместимостью 5 мл. Проводят три параллельных измерения.

Содержание аминного азота в исследуемом препарате в процентах (Х) вычисляют по формуле:

 

V x K x 1,4 x 100

X = -----------------,

C

 

где:

V - количество раствора натрия гидроксида концентрации 0,1 моль/л, использованное на титрование испытуемой пробы, мл;

K - поправка к титру раствора натрия гидроксида концентрации 0,1 моль/л;

1,4 - количество аминного азота, эквивалентное 1 мл раствора натрия гидроксида концентрации 0,1 моль/л, мг;

С - анализируемая навеска сухого препарата, содержащаяся в титруемом объеме А, мг.

 

19. Определение сахаров с антроновым реактивом

 

Метод основан на способности углеводов после дегидратации образовывать производные фурфурола, которые дают цветную реакцию с антроном.

Методика определения. К 1 мл препарата, содержащего 10 - 50 мкг сахаров, предварительно охлажденного в бане со льдом, по стенке пробирки осторожно приливают 2 мл свежеприготовленного антронового реактива (0,2%-ный раствор антрона в концентрированной серной кислоте, х.ч.). Смесь хорошо перемешивают и нагревают в кипящей водяной бане в течение 15 мин., после чего охлаждают.

Оптическую плотность определяют в кювете толщиной слоя 10 мм на спектрофотометре при длине волны 625 нм по сравнению с контрольным раствором, содержащим 2 мл антронового реактива и 1 мл растворителя, используемого для приготовления исследуемого препарата.

По калибровочному графику находят содержание сахаров в препарате.

Калибровочный график. 0,01 г (точная навеска) глюкозы растворяют в мерной колбе, вместимостью 100 мл, в воде и доводят объем раствора водой до метки (0,01%-ный раствор). К 0,1 - 0,5 мл полученного раствора (10 - 50 мкг глюкозы) с интервалом 0,1 мл прибавляют воду соответственно до 1 мл. Далее анализ проводят, как указано выше.

Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

 

20. Определение О-ацетильных групп

 

Метод основан на способности О-ацетильных групп образовывать с гидроксиламином в щелочной среде гидроксановую кислоту, которая дает цветную реакцию с ионами трехвалентного железа в кислой среде.

Метод рекомендован для анализа группоспецифических полисахаридов менингококковых и других полисахаридных вакцин.

Методика определения. К 1 мл исследуемого раствора, содержащего 1,5 - 2,5 мкмоля О-ацетильных групп (0,1%-ный раствор испытуемого препарата в воде), прибавляют 2 мл свежеприготовленного реактива 1, перемешивают и оставляют на 4 мин. при температуре 18 - 20 °С. Прибавляют 1 мл разведенной соляной кислоты, перемешивают, прибавляют 1 мл раствора железа (III) хлорида концентрации 0,37 моль/л, перемешивают и оставляют на 15 мин.

Оптическую плотность измеряют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольным раствором, содержащим 1 мл воды и указанные выше реактивы, добавленные в той же последовательности.

По калибровочному графику определяют количество микромолей О-ацетильных групп на 1 мг полисахарида с учетом содержания влаги в препарате.

Калибровочный график. Растворяют 0,136 г (точная навеска) ацетилхолина йодистого в мерной колбе, вместимостью 100 мл, в растворе натрия ацетата концентрации 0,001 моль/л и доводят общий объем раствора тем же растворителем до метки (5 мкмоль О-ацетильных групп в 1 мл). К 0,1 - 0,6 мл полученного раствора (0,5 - 3,0 мкмоля О-ацетильных групп) с интервалом 0,1 мл прибавляют воду соответственно до 1 мл и далее проводят анализ, как указано выше.

Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Примечания. 1. Приготовление реактива 1. Смешивают равные объемы раствора гидроксиламина концентрации 2 моль/л и раствора натрия гидроксида концентрации 3,5 моль/л.

2. Приготовление раствора гидроксиламина концентрации 2 моль/л. Растворяют 69,5 г (точная навеска) гидроксиламина солянокислого (х.ч.) в мерной колбе, вместимостью 500 мл, и доводят объем водой до метки. Раствор хранят при температуре 4 - 8 °С в течение 1 мес.

3. Приготовление раствора натрия гидроксида концентрации 3,5 моль/л. Растворяют 70,0 г натрия гидроксида (х.ч.) в воде в мерной колбе, вместимостью 500 мл, и доводят объем раствора водой до метки.

4. Приготовление разведенной соляной кислоты. Смешивают один объем концентрированной соляной кислоты (х.ч.) с двумя объемами воды.

5. Приготовление раствора железа (III) хлорида концентрации 0,37 моль/л. Растворяют 50,0 г железа (III) хлорида водного (х.ч.) в растворе соляной кислоты концентрации 0,1 моль/л в мерной колбе, вместимостью 500 мл, и доводят объем раствора тем же растворителем до метки.

6. Приготовление раствора натрия ацетата концентрации 0,001 моль/л. Растворяют 0,068 г натрия ацетата трехводного (х.ч.) в воде в мерной колбе, вместимостью 500 мл, и доводят объем раствора водой до метки. Устанавливают в растворе pH 4,5 с помощью раствора уксусной кислоты концентрации 1 моль/л.

 

21. Определение фосфора

 

Метод основан на способности неорганического фосфора в кислой среде образовывать с молибденовой кислотой фосфорно-молибденовую кислоту, которая в присутствии аскорбиновой кислоты дает цветную реакцию.

Метод рекомендован для химических вакцин.

Методика определения. В пробирку из тугоплавкого стекла 200 x 20 мм вносят 1 мл раствора препарата, содержащего 40 - 50 мкг фосфора. Пробу помещают в сушильный шкаф при температуре 100 - 110 °С до полного удаления влаги, не допуская обугливания препарата, и прибавляют 0,2 мл концентрированной серной кислоты (х.ч.). Пробирку закрывают стеклянным колпачком и пробу минерализуют на песочной бане до появления белых паров. Для ускорения минерализации используют пергидроль, который периодически прибавляют в предварительно охлажденные пробирки по 1 - 2 капли. После обесцвечивания раствора и появления белых паров продолжают минерализацию в течение 1 ч. Одновременно в аналогичных условиях выпаривают и минерализуют контрольную пробу, содержащую 1 мл воды.

Содержимое каждой пробирки охлаждают, количественно переносят в мерную колбу, вместимостью 25 мл, смывая 4 - 5 раз порциями воды по 4 - 5 мл, и доводят объем водой до метки. В пробирку с притертой пробкой вносят 4 мл полученного раствора и 4 мл реактива, перемешивают и выдерживают в течение 1 ч в водяной бане при температуре 37 °С. Измеряют оптическую плотность охлажденных образцов на фотоэлектроколориметре марки КРК-3 при длине волны 750 нм в кювете с толщиной слоя 5 мм по сравнению с контрольным раствором, приготовленным аналогичным образом из контрольной пробы. Содержание фосфора в 1 мл исследуемого образца в микрограммах (X) вычисляют по формуле:

 

X = а x 25,

 

где:

а - количество фосфора, найденное по калибровочному графику, мкг;

25 - разведение исследуемого образца.

Калибровочный график. 0,3509 г калия дигидрофосфата (х.ч.), доведенного до постоянной массы в эксикаторе над безводным кальция хлоридом, помещают в мерную колбу, вместимостью 1 л, прибавляют 700 - 800 мл воды, 20 мл раствора серной кислоты концентрации 0,05 моль/л и доводят объем водой до метки (80 мкг фосфора в 1 мл).

Отбирают в мерные колбы, вместимостью 100 мл, от 1 до 4 мл полученного раствора с интервалом 0,5 мл (0,8 - 3,2 мкг фосфора). Прибавляют 70 - 80 мл воды, 0,2 мл раствора серной кислоты концентрации 0,05 моль/л и доводят объем водой до метки. Пробы колориметрируют, как описано выше, по сравнению с контрольным раствором, содержащим 99,8 мл воды и 0,2 мл раствора серной кислоты концентрации 0,05 моль/л.

Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Примечания. 1. Приготовление раствора серной кислоты концентрации 3 моль/л. В мерную колбу, вместимостью 1 л, приливают 600 - 700 мл воды, 167,4 мл концентрированной серной кислоты и доводят объем водой до метки.

2. Приготовление 2,5%-ного раствора аммония молибдата. Растворяют 25 г аммония молибдата в колбе, содержащей 700 мл кипящей воды, при помешивании. Раствор оставляют при температуре 18 - 25 °С на сутки, переносят количественно в мерную колбу, вместимостью 1 л, и доводят объем водой до метки. Раствор фильтруют через два слоя фильтровальной бумаги и сохраняют в склянке из темного стекла с притертой пробкой.

3. Приготовление 10%-ного раствора аскорбиновой кислоты. Растворяют 2 г аскорбиновой кислоты в воде в мерном цилиндре и доводят объем раствора водой до 20 мл. Раствор готовят в день проведения анализа.

4. Приготовление реактива. Смешивают один объем раствора серной кислоты концентрации 3 моль/л, два объема воды, один объем 2,5%-ного раствора аммония молибдата и один объем 10%-ного раствора аскорбиновой кислоты. Все реактивы прибавляют при помешивании. Реактив готовят в день проведения анализа.

 

22. Определение нуклеиновых кислот по методу Спирина

 

Метод основан на измерении разности показателей оптической плотности гидролизатов препарата, характеризующей содержание фосфора нуклеиновых кислот.

Методика определения. К 1 мл препарата (15 - 35 мкг нуклеиновых кислот) прибавляют 5 мл 0,5 моль/л раствора хлорной кислоты. Смесь нагревают в кипящей водяной бане в течение 20 мин. После охлаждения пробы центрифугируют в течение 20 мин. при 2000 об./мин. Измеряют оптическую плотность надосадочной жидкости на спектрофотометре в кювете толщиной слоя 10 мм при двух длинах волн: 270 нм и 290 нм по сравнению с контрольным раствором, которым служит раствор хлорной кислоты концентрации 0,5 моль/л.

Содержание нуклеиновых кислот в микрограммах на 1 мл (X) вычисляют по формуле:

 

D270 - D290

X = ----------- x 10,3 x 6,

0,19

 

где:

D270 и D290 - значения оптической плотности при соответствующей длине волны;

0,19 - удельная экстинкция;

10,3 - коэффициент пересчета количества фосфора на нуклеиновые кислоты;

6 - разведение препарата.

Примечание. Метод применим при выполнении условия: D270 и D290 - не должны отличаться более чем на 15%.

 

23. Определение однородности сывороточных препаратов

методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы

 

Метод основан на различной скорости перемещения белков в электрическом поле в зависимости от соотношения основных и кислотных групп белка, pH и ионной силы буферного раствора. Метод рекомендован для препаратов иммуноглобулина.

Методика определения. На увлажненные пленки размером 90 x 90 мм, заправленные в специальные рамки, наносят исследуемые препараты дозирующим устройством (2 - 4 мкл). Одновременно для идентификации фракций наносят контрольный образец - плацентарную или донорскую сыворотку. Предварительно в электродные секции камеры (аппарат для электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы) наливают барбиталовый буферный раствор (100 мл) до риски, обозначенной на камере.

В камеру помещают две рамки так, чтобы линии нанесения препаратов находились ближе к катоду, а не к краю рамки. Затем разделительную камеру закрывают крышкой, включают источник питания (сила тока 8 - 10 мА, напряжение 100 - 120 В). Разделение проводят 30 - 40 мин. По истечении этого времени прибор выключают и снимают крышку разделительной камеры, при этом конденсационная вода не должна попадать на пленки. Рамки с пленками извлекают из камеры и дают подсохнуть на воздухе. Пленки вынимают из рамок пинцетом, избегая контакта с участками, где проходил электрофорез препаратов.

Пленки отрезают с обоих концов (около 2,5 мм) и помещают в кювету с 50 мл раствора красителя, выдерживают в течение 5 мин. (не более, т.к. пленка сморщивается). С уменьшением концентрации красителя время окраски можно увеличить до 10 мин. Пленку вынимают из кюветы и после стекания избыточной жидкости помещают на 5 мин. поочередно в три кюветы, которые содержат по 100 мл отмывочной смеси. Покачивание кюветы ускоряет процесс отмывки. Фон пленки после отмывки должен быть белым. После чего пленку тщательно промывают водой и сушат между листами фильтровальной бумаги, слегка промокая.

Идентификацию белковых фракций препарата проводят путем сравнения его электрофореграммы с электрофореграммой нормальной сыворотки, полученной при том же разделении. Сыворотка должна разделиться не менее чем на 5 фракций: альбумин, альфа 1 и альфа 2-глобулины, бета-глобулин и гамма-глобулин, считая от анодного конца пленки. В случае неоднородности препарата проводят количественное определение примесей путем извлечения краски из пленки элюирующим раствором с последующим колориметрированием или путем денситометрирования электрофореграмм.

а) Обработка электрофореграмм путем извлечения краски из пленок и колориметрического определения фракций.

Извлечение краски отдельных фракций проводят в 3 мл элюирующего раствора с 2-х параллельных электрофореграмм. Элюцию проводят в течение 40 мин. при многократном встряхивании. Оптическую плотность элюата измеряют на спектрофотометре при длине волны 620 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм по отношению к элюату неокрашенного участка электрофореграммы. Сумму оптических плотностей фракций принимают за 100% и определяют, какой процент по отношению к ней составляет оптическая плотность каждой фракции.

б) Обработка электрофореграмм при помощи денситометра.

Электрофореграммы препаратов высушивают между листами фильтровальной бумаги в полиэтиленовом пакетике. Эти условия высушивания исключают сморщивание пленки. Высушенные пленки просветляют вазелиновым маслом. Пропитывают пленки вазелиновым маслом таким образом, чтобы в пленке не остались пузырьки воздуха. Пленку держат горизонтально и нижней поверхностью осторожно касаются масла. Избыток вазелинового масла удаляют, промокая пленки между двумя листами фильтровальной бумаги.







Дата добавления: 2015-09-18; просмотров: 481. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Композиция из абстрактных геометрических фигур Данная композиция состоит из линий, штриховки, абстрактных геометрических форм...

Важнейшие способы обработки и анализа рядов динамики Не во всех случаях эмпирические данные рядов динамики позволяют определить тенденцию изменения явления во времени...

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ МЕХАНИКА Статика является частью теоретической механики, изучающей условия, при ко­торых тело находится под действием заданной системы сил...

Теория усилителей. Схема Основная масса современных аналоговых и аналого-цифровых электронных устройств выполняется на специализированных микросхемах...

Искусство подбора персонала. Как оценить человека за час Искусство подбора персонала. Как оценить человека за час...

Этапы творческого процесса в изобразительной деятельности По мнению многих авторов, возникновение творческого начала в детской художественной практике носит такой же поэтапный характер, как и процесс творчества у мастеров искусства...

Тема 5. Анализ количественного и качественного состава персонала Персонал является одним из важнейших факторов в организации. Его состояние и эффективное использование прямо влияет на конечные результаты хозяйственной деятельности организации.

Растягивание костей и хрящей. Данные способы применимы в случае закрытых зон роста. Врачи-хирурги выяснили...

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ИЗНОС ДЕТАЛЕЙ, И МЕТОДЫ СНИЖЕНИИ СКОРОСТИ ИЗНАШИВАНИЯ Кроме названных причин разрушений и износов, знание которых можно использовать в системе технического обслуживания и ремонта машин для повышения их долговечности, немаловажное значение имеют знания о причинах разрушения деталей в результате старения...

Различие эмпиризма и рационализма Родоначальником эмпиризма стал английский философ Ф. Бэкон. Основной тезис эмпиризма гласит: в разуме нет ничего такого...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.011 сек.) русская версия | украинская версия