ЯМР и ЭПР исследования.

Наиболее полные сведения об агрегатном состоянии липидных бислоев дают методы радиоспектроскопии ЭПР и ЯМР.

Электронный парамагнитный резонанс – это явление резкого возрастания поглощения энергии электромагнитной волны системой парамагнитных частиц (электронов с некомпенсированными спинами), помещенных во внешнее магнитное поле при резонансной частоте волны. Использование ЭПР заключается в исследовании спектров ЭПР. Спектром ЭПР называется зависимость мощности поглощения электромагнитной волны от величины магнитной индукции внешнего поля. Чем сильнее взаимодействие между атомами и молекулами образца, тем спектры ЭПР шире. Чем слабее взаимодействие между частицами (подвижность молекул больше), тем уже спектр ЭПР. По ширине спектров ЭПР можно судить о подвижности молекул веществ.

Так как молекулы фосфолипидов диамагнитные, для ЭПР-исследований биомембран используются спин-зонды и спин-метки – молекулы или молекулярные группы с неспаренными электронами.

Парамагнитные спин-зонды вводятся в липидную мембрану, спектры поглощения спин-зондами электромагнитной волны дают информацию о свойствах липидного окружения, в частности о подвижности липидных молекул в мембране. Этот метод обладает существенным недостатком – внесение в биологический объект чужеродных молекул-зондов может изменять структуру объекта. От этого недостатка свободен метод ЯМР.

Ядерный магнитный резонанс – это явление резкого возрастания поглощения энергии электромагнитной волны системой атомных ядер, обладающих магнитным моментом, помещенных во внешнее магнитное поле при резонансной частоте волны.

Как и в случае ЭПР, спектры ЯМР тем шире, чем больше вязкость и меньше молекулярная подвижность исследуемого объекта.

 

5.Потенциал покоя

Экспериментально установлено, что между поверхностями биомембраны невозбужденной клетки существует разность потенциалов, часто называемая для краткости потенциалом покоя:

÷ (XII.1)

 

Однако до начала XX века этот вопрос (как и вообще природа электричества в живом организме) был предметом спора, суть которого можно коротко выразить тезисом: непонятно, возникает ли электричество, например, в мышце только в момент ее повреждения или существует и до него. Не имея возможности рассказать об истории этого спора до начала XX века, укажем, что только к этому времени Э. Бернштейну удалось понять, что электрические свойства мышц и нервов обусловлены не особенностями их устройства как целого, а свойствами и особенностями мембран составляющих их клеток. Этот ученый по праву считается основателем мембранной теории биопотенциалов (первая его статья была опубликована в 1902 г.).

Разберем, что такое потенциал покоя и как он возникает. Представим себе, что внутри клетки имеется много свободных ионов какого-нибудь элемента (рис. 1.) и клеточная мембрана пропускает только эти ионы. Естественно, они начнут двигаться наружу и вместе с ними наружу будет выноситься положительный заряд. В результате между внутренней и наружной поверхностями мембраны возникает разность потенциалов (рис. I.2.). Потенциал наружной поверхности будет больше, чем потенциал внутренней (при этом разность концентраций ионов внутри и снаружи будет к этому моменту еще довольно значительной). Эта разность потенциалов будет тормозить движение наружу новых положительных ионов и увеличивать их поток внутри клетки. В конце концов эти потоки станут равными по величине (установится динамическое равновесие), а суммарный поток будет равным нулю. Установившаяся при этом между поверхностями биомембраны разность электрических потенциалов и есть потенциал покоя.

Его величину можно вычислить из условия равенства электрохимических потенциалов внутри и снаружи клетки . Используя для нахождения электрохимического потенциала формулу, получим:

 

После несложных преобразований получим:

Разность и есть обсуждаемый нами потенциал покоя:

Очень слабым местом мембранной гипотезы в то время было отсутствие данных о том, концентрацию каких ионов следует подставлять в полученную формулу, чтобы получить значение , близкое к наблюдаемому в эксперименте.

В 1905 г. в Берлине Гебер, один из молодых сотрудников Нернста, обнаруживает, что почти все соли, содержащие калий, оказывают на мышцу одинаковое действие: участок мышцы, на который действовал раствор такой соли, приобретал отрицательный потенциал по отношению к другим участкам. Бернштейн сразу же оценил значение работы Гебера: стоило только предположить, что потенциал покоя создается именно ионом калия и подставить в формулу соответствующие концентрации, как получался результат, близкий к эксперементальному.

Однако даже после выхода в 1912 г. в свет фундаментальной книги Э. Бернштейна «Электробиология» мембранная теория не вызывала особого доверия ученых, так как не было ее прямых подтверждений. Наиболее интенсивным нападкам подвергалось само существование мембраны (ее увидели при использовании электронной микроскопии лишь во второй половине XX века).

Еще одной экспериментальной проблемой было определение ионного состава внутренней среды. Ученые пытались использовать для определения этого состава самые разные методы, но все полученные данные были лишь приблизительными: клетки слишком малы, а между ними всегда имеются межклеточное вещество и жидкость. Кроме того, сторонникам мембранной теории надо было показать не просто присутствие калия внутри клеток, а присутствие именно свободных, несвязанных ионов калия. Эта проблема была решена с разработкой новых методов измерения и подбором подходящего объекта

В 1936 г. английский специалист по головоногим моллюскам Дж. Юнг обнаружил у кальмаров нервное волокно, диаметр которого доходил до 1 мм, т.е. гигантское по клеточным масштабам, хотя сам моллюск вовсе не был гигантом. Такое волокно, выделенное из организма и помещенное в морскую воду, не погибало. Появилась живая клетка, в которую можно было проникнуть, и с которой можно было работать.