МИКРОТОМЫ И ПРИЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕЗОВ НА НИХОбъектом патологогистологического исследования является срез. Срезы могут быть изготовлены толщиной 1-2 мкм. Наиболее употребительными являются срезы толщиной 6-12 мкм. Аппараты, на которых изготовляются срезы, называются микротомами (греч. «микрос» — малый и «темно» – режу). Наиболее употребительными микротомами являются: 1. Замораживающие микротомы: а) цилиндрический, системы «Сарториус»; б) микротом ТОС-1с термоэлектрическим охлаждающим столиком. 2. Санный (салазочный) микротом. 3. Микротом Майнота (Minot) для изготовления серийных срезов с парафиновых блоков. 4. Ультрамикротомы различных марок. Основных частей у каждого микротома пять: 1) станина; 2) держатель ножа; 3) предметный столик; 4) микрометрическая установка; 5) микротомный нож. Станина представляет собой массивную устойчивую основу аппарата. Держатель ножа снабжается установкой, позволяющей регулировать наклон ножа. Предметный столик служит для фиксации объекта. Микрометрическая установка служит для автоматической подачи объекта к ножу с целью получения срезов необходимой толщины. Главной составной частью ее является микрометрический винт, т.е. винт с очень тонкой нарезкой. Микротомные ножи бывают трех марок: А) нож из самой мягкой стали, употребляемой для резки парафиновых блоков; В) нож из более твердой стали – для резки парафиновых и целлоидиновых блоков; С) нож из самой твердой стали, употребляется для получения замороженных срезов, имеет профиль равнобедренного треугольника. Марка стали обозначается на обушке ножа.
Работа на замораживающем микротоме На замораживающем микротоме изготавливаются срезы с объектов, обладающих достаточной компактностью. Достоинства замораживающей методики микротомирования: 1) отсутствие необходимости в заливке; 2) быстрота и простота изготовления срезов. Недостатки замораживающей методики: 1) невозможность получения серийных срезов; 2) невозможность получения тонких срезов (минимальная толщина 10 мкм); 3) мелкие и рыхлые объекты резать нельзя. Изготовление срезов на замораживающем микротоме 1. Опустить предметный столик при ближнем положении ручки микротома. 2. Положить кусочек материала на столик. 3. Смочить кусочек водой. 4. Вложить в гнездо ручки микротома нож марки «С». 5. Поднять столик до соприкосновения кусочка с лезвием ножа. 6. Установить регулятор толщины срезов. 7. Открыть кран баллона. 8. Заморозить кусочек до появления звонкого звука при постукивании по нему. 9. Выровнять поверхность кусочка. 10. Получить срезы и перенести их в чашку с водой. 11. По окончании резки закрыть кран балпона. 12. Вынуть нож, осушить, положить на место хранения. 13. Удалить кусочек с предметного столика. 14. Вытереть досуха части микротома. Работа на санном микротоме Микротом называется санным, так как части его передвигаются в особых пазах и скользят наподобие саней. Путем смены предметных столиков соответствующей конструкции санный микротом может быть приспособлен для резки любых блоков и поэтому называется универсальным микротомом. Наклеенный на кубик блок вынимают из 70%-ного этанола и прочно укрепляют в объектодержателе санного микротома. Используются ножи типа «А» и «Б». Угол наклона ножа острый и регулируется в зависимости от плотности блока: чем мягче объект, тем острее угол наклона. Нож и объект регулярно смачивают 70%-ным этанолом (мягкой кисточкой). При необходимости срезы расправляют на лезвии легким нажатием кисточки или подушечки пальца. Расправленные срезы переносят в чашку Петри, заполненную 70%-ным этанолом. В некоторых случаях для хорошего расправления срезы можно перенести из 70%-ного этанола в дистиллированную воду, где они выравниваются вследствие резкого изменения поверхностного натяжения. Работа на микротоме Майнота Особенностью микротома является неподвижное положение бритвы и передвижение объекта к бритве при каждом срезе, что обеспечивает получение серийных срезов. Для резания парафиновых блоков применяют ножи марки «А» или «В». Блоки, наклеенные на кубики, закрепляют в объектодержателе. Подбирают углы резания и наклона ножа. Нож укрепляют или перпендикулярно к длиннику микротома, или косо. Подгоняют блок к ножу так, чтобы между ними было расстояние 0,5-1 мм. Скальпелем срезают избыток парафина, а микротомным ножом – поверхностные слои материала. Движения микротомного ножа должны быть плавными и быстрыми. Если материал хорошо залит, правильно подобраны углы резания и наклона ножа лезвие острое, то срезы размещаются на поверхности ножа в виде ленты.
При неправильной обрезке блока срезы имеют угловатые контуры, при наличии зазубрин ножа рвутся. Полученные срезы с бритвы снимают мягкой кисточкой или препаровальной иглой (не касаясь лезвия!) и переносят в теплую (40°С) кипяченую воду, причем стороной, которая была обращена к ножу. В воде их расправляют, затем обезжиренное стекло с нанесенным клеем (методику наклеивания см. ниже) одним концом опускают в чашку с водой, к нему препаровальной иглой подводят срез и постепенно вытягивают из воды. Можно взять предметное стекло, подвести под срез под углом 45°, край среза прижать к стеклу, а затем его вместе со срезом вынуть из воды. Предметные стекла с расправленными на них срезами осушивают гладкой фильтровальной бумагой (рис. 9,10). Замороженные и целлоидиновые срезы подвергают окраске без предварительной обработки. Парафиновые срезы наклеивают на предметное стекло и депарафинируют. Наиболее употребительным способом наклейки парафиновых срезов является так называемый «японский» способ при помощи яичного белка. Рецепт клея для наклейки срезов Яичного белка – 2 ч.Глицерина – 1 ч.Камфоры (тимола) – 1 кристаллик (противогнилостное средство). Ход наклейки 1. Обезжиривание предметных стекол проводится при помощи обработки их поверхности: спирт-эфиром или мылом. 2. Наносят каплю клея, растирают ее пальцем на поверхности предметного стекла до ощущения сухости. 3. Коагулируют белок на пламени горелки. 4. Вылавливают срез из воды на стекло или сухой срез кладут на предметное стекло и подливают под него пипеткой несколько капель теплой воды. Благодаря этому уничтожаются складки среза. 5. Подсушивают срез на стекле при комнатной температуре или в термостате. Наклеенные срезы могут храниться неопределенный период времени. Депарафинирование Депарафинированием называется удаление парафина с наклеенного среза. Депарафинирование производится непосредственно перед окраской. 1. Стекло со срезом опускается в растворитель парафина (ксилол, толуол, бензол) до удаления парафиновой каемки вокруг среза. 2. Удаляют растворитель парафина погружением стекла со срезом в спирт-ректификат или абсолютный спирт. 3. Ополаскивают стекло в воде. Методы окраски срезов и заключение их под покровное стекло. Употребляемые в гистологической технике краски делятся на 4 группы: 1. Кислые (фоновые, протоплазматические) краски, например, эозин, фуксин кислый, пикриновая кислота, отсюда и термин оксифилия – любящий кислоту, так как некоторые тканевые элементы воспринимают или окрашиваются только кислыми красителями. 2. Основные (ядерные), например, гематоксилин. 3. Нейтральные, например, метиленблау, нейтраль-рот (нейтрофилия). 4. Специальные, например, судан III и др. Процесс окраски заключается в обработке среза в красящих растворах, контрастных по цвету и различных по химическому характеру. Эозин (кислая краска красного цвета) реагирует со щелочной протоплазмой (оксифилия). Гематоксилин (краска с щелочной реакцией лилового цвета) реагирует с кислым ядром (базофилия). Метахромазия – такое явление, когда краска окрашивает ткань в другой цвет, нежели она сама. Например, тионин, муцикармин и др. являются красками синего цвета, а слизь окрашивают в красный цвет.
Способы окраски 1. Гематоксилин-эозин – обязательная ориентировочная окраска. 2. Дополнительные методы окраски, например, на соединительную ткань, жир, гемосидерин, эластику и т.д. Следует помнить, что на качество окраски влияют способ фиксации, а также предварительная и последующая обработка препарата. Красящие растворы должны быть чистыми, для чего любой краситель необходимо перед употреблением отфильтровывать, а водный раствор готовить только на дистиллированной воде. Окрашивать лучше красками низкой концентрации в течение длительного времени. Лучше срезы перекрашивать, а затем доводить до требуемой окраски путем отмывания в соответствующей жидкости, что позволяет более отчетливо видеть определенные элементы тканей. Окраска должна вестись под контролем микроскопа.
|
