Занятие № 29

ТЕМА. ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ АММИАКА В ОРГАНИЗМЕ. ОРНИТИНОВЫЙ ЦИКЛ МОЧЕВИНООБРАЗОВАНИЯ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ОБМЕНА БЕЛКОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.

 

Цель занятия: 1.Изучить пути образования и обезвреживания аммиака.

2.Освоить методы количественного определения мочевины и остаточного азота в сыворотке крови.

Исходный уровень знаний:

- химия аминокислот;

- реакции дез-, трансаминирования аминокислот;

- классификация и номенклатура ферментов;

- строение витаминов В₂, РР, В₆ и содержащих их коферментов.

Содержание занятия.

I.2.Пути образования и обезвреживания аммиака в организме.

Способы обезвреживания аммиака.

Синтез мочевины: химизм, ферменты, нарушения.

 

II.1.Работа № 1. КОЛИЧЕСТВЕНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЧЕ-ВИНЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (набор "Биотест")

Принцип метода.

Мочевина образует с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбазида и ионов Fe³⁺ в сильнокислой среде красный комплекс, который фотометрируют.

Порядок выполнения работы.

Приготовить рабочий раствор, смешав одну долю раствора Реактива с одной долей раствора серной кислоты.

Осадить сывороточные белки: в центрифужную пробирку налить 1мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), добавить 0,1 мл сыворотки и центрифугировать 10 мин при 1500 об/мин. Для анализа использовать супернатант.

Так же разбавить эталонный раствор: к 1мл 5% раствора ТХУ добавить 0,1 мл эталонного раствора мочевины.

Реактивы (мл)	Проба	Эталон	Раствор сравнения
Рабочий раствор	2,0	2,0	2,0
Супернатант	0,1	-	-
Эталонный раствор	-	0,1	-
Дистиллированная вода	-	-	0,1

 

Пробирки закрыть крышкой из фольги и нагреть точно 10 мин на кипящей водяной бане, охладить (2-3мин) в струе холодной воды и не позже, чем через 15 мин измерить оптическую плотность пробы и эталона против раствора сравнения в кювете 1 см при 490-540 нм (светофильтр №5, зеленый).

 

РАСЧЕТ. Концентрацию мочевины (Х) рассчитывают по формуле:

А

Х= ― • 16,65 ммоль/л, где

В

А - оптическая плотность пробы,

В - оптическая плотность эталона.

 

Можно сделать перерасчет мочевины в азот мочевины умножением на коэффициент 0,466.

Нормальное содержание мочевины в сыворотке крови составляет 2,50-8,32 ммоль/л; в моче - 333-583 ммоль/сут.

Верхняя граница содержания мочевины зависит от приема белков с пищей. При приеме белков более 2,5 г/кг веса в сутки содержание мочевины в сыворотке может быть до 10 ммоль/л.

РЕЗУЛЬТАТ:

 

 

ВЫВОД:

 

Работа № 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТА-ТОЧНОГО АЗОТА ПО МЕТОДУ АССЕЛЯ.

Наряду с белками в крови содержатся азотсодержащие вещества небелкового характера. После удаления белков крови осаждением безбелковый фильтрат содержит еще азот, носящий название "остаточного азота" и слагающийся из азота мочевины, мочевой кислоты, креатина, креатинина, индикана, аминокислот и других веществ.

Принцип метода.

Безбелковый фильтрат минерализуется в присутствии серной кислоты и пергидроля. При этом весь азот органических соединений превращается в сернокислый аммоний, который определяется колориметрически с реактивом Несслера.

Порядок выполнения работы.

В пробирку отмерить 2,8 мл фосфорномолибденового реактива, добавить микропипеткой 0,2 мл крови, взболтать и оставить на 30 мин. Осадок белка отфильтровать. К 1 мл фильтрата прилить 0,05мл (2 кап) концентрированной серной кислоты. Во 2-ую пробирку поместить 2 кап концентрированной H₂SO₄ и содержимое обеих пробирок сжечь на песочной бане (При нагревании жидкость в 1 пробирке буреет). Обе пробирки снять с огня, остудить, добавить по 2-3 кап. пергидроля и снова нагреть до полного обесцвечивания. После сжигания пробирки охладить и прибавить по 10 мл воды, 0,2 мл 50% раствора NaOH и 0,5 мл реактива Несслера. Испытуемая жидкость окрашивается в желтый цвет.

В контрольную пробирку прилить из микробюретки стандартный раствор сернокислого аммония по каплям до получения одинаковой окраски с опытным раствором. Количество раствора зафиксировать.

 

РАСЧЕТ. Количество остаточного азота вычисляют по формуле:

А • 0,05 • 100

Х = мг%, где

0,067

а - кол-во мл стандартного раствора, пошедшего на титрование;

0,05 - количество азота в 1 мл стандартного раствора в мг;

0,067 - количество крови, взятой для сжигания (одна треть от 0,2 мл крови, взятой для осаждения белков).

РЕЗУЛЬТАТ:

 

ВЫВОД:

 

 

III.2. Контрольные вопросы.

Каково нормальное содержание мочевины в крови? в моче?

В каких случаях содержание мочевины в крови повышается?

О чем свидетельствует снижение содержания мочевины в крови? Что такое "остаточный азот"?

Каково нормальное количество остаточного азота в крови?

Что такое азотемия и когда наблюдается?

 

Материал для самоподготовки. а)1 с.431-451; II, III