Физическое картирование
1 этап – построение рестрикционной карты, используя маркер интересующего фрагмента, можно определить его физ положении в карте рестрикции. Выделяем хромосомную ДНК бактерий, с помощью плазмиды. Выделенная ДНК д.б. чистой. Обрабатывают рестриктазами, чем больше тем более полная карта. Если используем 3 варианта, то используют 3 попарных варианта. Определить на каком фрагменте лежит интересующий нас маркер – саузерн-блот гибридизации. На 1 этапе происходит разрезании геномной ДНК рестриктазой и разделение получившихся фрагментов на агарозном геле. Перенести рестрикционные фрагменты на носитель – нитроцеллюлозный фильтр. Перед переносом необходимо фрагменты ДНК денатурировать – можно 2 сп-ми: замочить исследуемы гель в растворе щелочи, фарез в денатурирующих условия с формальдегидом (распиратор). Переносим на фильтр: в тазик ставим платформу, ладем фильтровашку концами ко дну тазика, далее гель, нитроцеллюлозный фильтр, фильтроватьная бумага, груз, в тазик наливаем буфер для переноса. Буфер по в фильтровальной через гель на полотенца (фильтров) и идет ток жидкости и выносят ДНК, которые застревают в фильтре. 2 – памрес, вырезается кусок по размеру с гелем и вместо полотенец кладется. Время около ночи. Гель можно поместить в камеру с электродами – часа 3. Молекулы ДНК дополнительно закрепляют на нитроцеллюл фильтре – обработка УФ. Берем маркерный участок, метим фрагмент или флюорисцентной меткой или радиоактивной (прикрепит молекулу, содержащую изотоп или нуклеотиды, вставить во время синтеза). Д енатурируем фрагмент, смешивает с буфером для гибридизации и помещаем нитроцеллюлозный фильтр в раствор буфера, в котором находится маркер. Необходимо учит температуру. Если к маркеру есть комплимент ДНК и образуют двойную связь. Чтобы не свзявалось с самой нитродец к маркеру добавляют другую ДНК. Заем вынимают фильтр и подносим к нему УФ светится все – необходимо отмыть – батарея буферов. Далее фильтр смотрят через ренгеновскую пленку, если слабая метка -сушим. Если сильна метка время экспозиции 12 часов, на экспозициюболее 2 недель бессмысленно.
|
