Метод FISH – флюоресцентная in situ гибридизация.

Самая большая проблема получиь пластинки, в них находтся диски эухроматина и гетерохроматина. Тонкое исследование остаточно проблематично. Изотопный анализ в системе ч-б. получали метофазную пластинку на стекле ее денатурир и смеш с зондом смеш флюрисц меткой, зонд гибридизировался с комплиментарным участком. Метод мгновенно просочился в клиник. В интерфазном ядре хром сохран и могут гибридизов, то можно не выделть интерфазные пластинки. Можно использовать на интерфазном ядре.

Фиш модно использовать для выявление дупликации. Можно детектировать делеции. Наиболее частоиспользуемых зондов – зонд к гену р53 –активно используется для диагностики онкологических заболеваний. Если нет делеции – то заболев можно вылечить препаратами.

Можно выявлять транслокации. Берем 2 зонда и ели у нас 4 отдельных пятна своего цвета, то никаких нарушений генома в данном фрагм не произошло. Если 2 нормальных пятна, а оставшиеся 2 другие, они сливаются- следоватьельно зонды слились – есть транслокация. Зонд на транслокацию – самый активноиспользуемый. Этот зонд ипользовался для гематологического заболевания – онкология крови.

Хронический миелолейкоз – при лейкозах бластые клетки недотрансформированы. В хронич лейкозе кл не доконца дифференцированы и медленно делятся. Срок жизни 4-5 лет. При образовании филадельфийской хромосомы- железный милолейкоз. Филадейфийская хромосома образ из трансолокации 9 и 22 хромосомы. Образ химер транскриптон химерной транскриптон тирозиновой киназы.

Был создан зодн к промотору и тирозин киназе. Если зонды располож на разных участках – здоров. Если слияние, диагноз поставлен.

ПЦР.

1 статья в 1986г. Было известно, что существуют спец затравки – они отожгутся на комплиментарные цепи ДНК. С ориджин связыва только ДНК-полимераза 3, 1-ая ДНк полимераза. ДНКполим 1 не содержа нуклазной активностью – фрагмент кленова – использ для зашивки брешей в ДНК, для синтеза, меченья фрагментов. Синтезируют на встречу – д2 фрагмента кленова. Далее денатурируем. И каждый следующий цикла. Циклическое повторение – денатурация 94С, затравка-матрица, достройка.

Пробема- оптимум температуры 37С у фрагмента кленова, после каждого этапа денатурации и отжига необходимо докапывать ДНК полимеразу. Основная пресс=лесть – использование таг – полимеразы из термус акватику – бактерия обитающая при 94С. Оптимум еевункционирвания 72 градуса, этот фермент в состоянии пережить темпер 94 градуса.

Условия ПЦР.

1. Матрица

2. Буфер, соли

3. Магний

4. Неионный детергент тритон 100

5. Смесь дезоксинуклеотидов

6. Затравки – праймеры – синтезируют в специальных фирмах. Концентрация праймеров 10пико моль на концентрацию, до 5 микомоль, редко 15-20 пикомоль. Можно синтезировать праймеры с помощью ПЦР (20-25 н).если меньше температура отжига ниже и отжигается со сходными (гомологичными) – специф ПЦР резко падает. Хотя в реакциях требуется получение набора полос –исп меньшие температуры. Меньше вероятность образования 2-ой цепью с соседним участком.

7. Taq – полимераза 1,25-2,5 единиц (до 10 единиц на реакцию)

На специфичность влияет правильный подбор праймеров. Необходимо проверить ГС состав. На 3 конце должна быть СС, ГГ. в праймере больше ГС – выше темпер отжига- выше специфичность и никаких блоков из 3-4 одинаковых букв- снижают специфичность.

Концентрация Mg влияет на специфичность – реакция иначе не пойдет, если его нет. Повышая концентрацию-повышаем специфичность.

Стандартный предел концентрации Mg от 1,5-3,5.

3 – температура отжига- это цикл ПЦР. 1 цикл – 1-5 мин на 94С. 2 цикл – амплификация м.б. одноэтапная, 2-х этапная.

1-этапная – наблюдается от 20-40 циклов. 30-35 самые частые циклы. Каждый цикл состоит из 3-х этапов. 1-денатурация от 30 сек-1 мин. Отжиг. Темпер зависит от темпер отжига праймеров. Разница в 1-2 градуса несмерт. От 30-1мин.3 –дотройка 70С –отптимум полимеразы. Зависит от длины амплифиц фрагмента за 50 сек – синтез 1 килобаза (1 тпн).

Иногда, когда высокая температруа отжига используется 2-х тактнй ПЦР, отжиг и достройка при одной температуре, объединяют. Для ГС богаых праймеров.

Двух этапный ПЦР на 1 этапе – накопительные циклы – характерно длямалого количества матри ДНК.5-10 циклов идет наработка с низкой специфичностью.

Достройка – необязат 70С, 5-10мин.

 

ПЦР используется для амплификации фрагментов. Просочился в клиническую практику.

ПЦР-ПДРФ

АК замена- это результат нуклеотидной замены. У ДНК есть сайты рестрикции. Если 1 нуклеотид и не входит в его состав сайта рестрикции и появляются сайты рестрикции. У одного не разрезается. У гомозиготного режутся все 3 фрагмента. Выявляют группу риска – рак легких. Сайт рестрикции может не возникнуть, а может исчезнуть. При мутации не режется.

VNTR- ПЦР – фариабельность количества повторов.

У бактерий сущетв тандемные повторы и когда идет репликация, тое уменьшится или увел кол-во тандемн повторов. Берем праймеры к фланкир областям и амплифиц фрагмент содерж повтор. Тот у кого повторов 4, длина фрагм 4Х.

ОТ-ПЦР – используется 1 прймер, используются субстраты, спец буфер, ревертаза синтезирует молекулы ДНК. РНК-аза Н. к 3 штрих концу –реперс праймер.

Выявляют вирусы получают дНк копии. Тжик в центре молекулы Днк. Медо для определения 3 – 3 штрих рейс. Для 5-аналогично. Используют адаптер и полиТпраймер. Получается к ДНК и ставится ПЦР – ставится с прямого праймера или праймера из двух частей. Получаем полАхвост. Полиаденелирование-расщепление матричных ДНК. Некоторые ДНК полиурегинирируются.

 

ПолиАполимераза может присоединять любые нуклеотиды.

Рибосомные РНК не имеют модификации на конце, что хар-но для большинства РНК.

5-RACE

Доводим до 5, кДНК обрабатывают, можифицируют, на 3 насаживают необходимые нуклеотиды. И образуется полиС-фрагмент. Димеры праймеры образуются, а не ДНК, которую необходимо отделить. Выделяем из геля то, что нас интересует, выделяем и ставим на ПЦР. Есть набор специальный набор отделения кДнк.

Метод определения нуклеотидной последовательность по Сенгеру.

Идет нарастание цепей, наращиваем только 1 цепь. Берем 1 праймер. Необходимо ограничить эти цепи. Использовались дидезоксинуклеотиды. Восстановлены оба гидроксила. Можно взять 4 типа дидезоксинуклеотида. Замешиваем ПЦР с 1 меченым рпаймером. Разделяем на 4 части. В 1 дидезокси А,В,С,Д. обчыно ДДОН чтобы соотношение было 10\1 – но у каждой фирмы сове соотношение. В результате будет набор амплифиц форагменто, оргвнис праймером, с другой гуанином. И наносим на гель GACT. И читаем последовательность. Использ специфческий гель – толщ 0,2 мм. Это позволяет разделять фрагменты, различающиеся на 1 нуклеотид.

Можно разогнать на стеклах – до 50 см. до 40 читабельно. С 1 автографа можно прочитать от 30-80(100).

Автоматизация пришла с внесением флюорисцент метки, вносимая в дидезоксинуклеотид. Аденин светися зеленым, гуанин фиолетовым, тимин-красным, цитозин-синий. Метод очень удобный. Получить заведомо до 600нуклеотидов.

 

-определение функций различных структур генома.

Позволяющие какие транс –элементы взаимодействют с цис элементами ()

 

Схема определения промоторов в митох кинетопластид.

1-консервативная, 2 –вариабельная (большое кол-во повторов)

2 праймера, присоед к возможно промотору, клонировала его в плазмиду, взяла праймер к промотеру, а 2 праймер в плазмиде. Амплифицировала весь промотре и участок плазмидной ДНК. Участок плазм ДНК- маркерный ген – транформирован в митохондрию. Синтезировали РНк и выделиле суммарную РНК. Поставили суммарную транскрипцию к бактериальной плазмиде.

РНк- будет давать обратнуб транскирипцию, след образовался ПЦР продукт, значит в исследуемом районе есть промотор. 12 нуклеотидов идентифицировали. Выбирая все меньше и меньше размер конс области.

 

Гетеро хроматизация. Исследуемая кострук вводит с пом-ю р эл-ов. Если произошло исчезновения функции, значит работает.

Группа методов, которые определяет тран-элементы: фут принт: меод задержки в геле и метод собственно фут принта.

Методом задержки получают комплекс исследуемой ДНк, метят его и смешивают с белком, часть ДНК оразует комплекс с белком. Наносим смесь на гель, так которая с белком движется медленнее. Свободная ДНК убегает значительно дальше. Комплекс ДНК белок сшивается – уф излучение. Обрабатываем нуклеазой, где произошша сшивка разрезать невозмонжо. Наносим на фарез. Наносят фрагмен, в которм определяют последовательность ГАТС.

 

Метод микрофарез – нанесение на гель в малых количествах и идентиф в малых количествах.

Опрееление через гибридизацию. Наосится на поверхность какой-то структуры набор различных зондов и в ним присоеденияется меченая молекула ДНК, но она связанная с гасителем. Когда происходит взаимод гаситеьл теряет связь с меткой и метка начинает светится. На 1 планшете можно определить большое кол-ко что где отжигается.

Идетификация белков – мпетод чипов.

Позволяет сренировать больие объемы за достаточно быстрое время.

 

 

Структура геномов прокариот.

Геном прокариот делится на хромосомный и нехромосомный. Основной геном хромосомный, образован хромосомой или нуклеоидом.

Бектериальная хромосома неограниченна мембраной, прикреплена к цитоплазматической мембране клетки. Всегда кольцевая и содержит основной набор генетической инормации для функционирования клетки. Длина генома 8*10в6 пн. Чем более бактерия самостоятельна тем длиннее ее геном. Геном паразитических бактерий короче, чем бактерий, которые ведут паразиический и сапрофитный образ жизни. У бактерий экстрималов значительно длиннее. ГС состав тоже достаточно сильно варьирует в предела 30-40 %. Между дальнородственными видами – как таксономич признак. Хромосомная ДНК содержит 1 точку репликации транскрип. Счит, что бактер кл гаплоидна. ДНК упорядочена, связана с белками. Саму структуру геном можно пдразделить на 2 части – кодирующая и некодир. Кодир ДНК составляет до 95%, в кодир ДНК входят открытые рамки считывания - от старт до стоп кодона, часть которая транслируется. В случае транспортных и рибосомных рнк – функцион часть от 1 до 2. Гены не перекрваются. Геном прокариот не имеет перекрываний и компактность не выходит далко. Некодирующей ДНК относится все остальное – но это функциональные элементы – ориджинрепликации. Состоит из не-ких инвертируемых и тандемных повторов. Очень АТ богатая, связываются белки инициации репликации. Регуляторный элементы транскрипции – открытая рамка считывания входит в состав транскриптон – промотор, регуляторн элементы, открыт рамка счит(несколько, которые кодируют белки одного метаболитического пути - оперон), терминатор. Оперонная организация генома. К регуляторным элементам транс – операт пром, регул термин.

Структура промотора – у эукариот четкая струткура не выявляется. Длина 80поснований. 1 точка инициации А/Г, 2 участка, распознающ ДНК –полимеразой. -10 домен прибного ТАТААТ от 5-9 пн, домен -35 ТТГАСА – высокий уровеньблока ТТГ. Расстояние между -9-36 16-19 п.н.

Сила промотера – частота инициации, частота перехода в открытый или закрытый комплекс. Самым сильным промтоер- консенсусный. Любое отклонению по структуре идет к ослаблению промотера. Для риб и транс сильные промотеры РНК. Регуляция процесса основана на наличии сильных и слабых промоторах.

Регуляция лактозного оперона.

2 элемент необходимый при регуляции инициации – оператор.

 

Регуляция с сигмой-субьединицей (определяет связвание, обеспечивает правильное узнавание). Мажорная сигма-субьединица (70) и если присутсвует данная субъединица то процесс будет осуществляться. Минорные сигмасубъединицы. Если данная субъединица экпрессируется, ее экспрессия регул индивид, то она может связаться с коровой частью РНК полимеразы, значит и связывается с соответсвующим промотором. Это характерно для беков теплового шока, и белки отвеч за споруляцию бацилл.

 

Регуляция а счет аттеньюаторов (регулируемые репрессоры) – характерен для прокариот, т.к. у них транскрипция и трансляция не разграничены во времени и пространстве. Перео опероном расположена регуляторная область, левее распол промотор. Апстрим ближе к 5, даунстрим ближе к 3.

 

РНК состоит из повторов. 1-2 образую шпильку, шп 3-4 ро-независимый терминатор. Шпилька 2-3 –не терминаторная. Лидерный пептид способствует образования терминаторных шпилек. Если мало триптофана то рибосома застрянет в критической области образ шпилька 2-3 и рибосома не застревает, а идет дальше.

 

Некодирующие ДНК 15%.

К нефункциональной части: спейсеры –межгенные промежутки (транскриб-внутри оперона и нестраскри –м\х оперонами) –частота мутации в спейсерах очень велика. К нефункц относятся: мобильные генетические элементы (IS-элементы и транспасозны) и вирусы. IS –корокая конструкция окруж инвентирован повторами – это сегменты ДНК, спсобные как целое перемещаться из одного участка в другой, 1 ген - транспозаза. Более сложные транспозоны - это IS элемент+ген, которой может принести пользу клетке (устойчивость к антибиотикам). Транспосозны отлич по типу транспозиции – консервативные и полуконсервативные.

Повторы могут встреч у эукариот в составе кодирющей – внося изменения, и некодир части. Повторы м.б. организованы в кластеры или структуры.

Вриабельные участки повторов. VNTR – повторы могут располаг внутри белков и так же внекодирующей части. Повторы очень часто используются мобильные гентич элементы для перемещения.

Наличие повторов увеличивает частоту мутации.

 

Нехромосомные элементы генома.

Могут перемещ в хромосому. Плазмиды, фаги и мигрурующие элементы.

Плазмиды – самореплец кольцевая молекула 1,5-40кбаз. Содержат ориджин репликации, соответсвующиц ориджину ьактерий. Наличие доп гена, который обеспечивает преимущество, автономная структура. Бактерии могут принимать плазмиду и выкидывать ее.

Существет несколько видов плазмид R – устойчив в А, Col – способные синтезир колицины, F – передают генетич информацию, Шу – синтез гомолизин, Tox – синтез токсины.

МОбильн генетич элементы -могут перемещаться. Фаги – действиют по литическому пути (быстро нарабатывается вирусная частица – разрыв кл –гибель кл), умеренные фаги – могут идти 2 путями: лизогенный высвоб из капсида, фаг встраив в геном и наслед-ся вместе с хозяиновм.; в результате мутации может вызвать гибель клетки.

Трансформация открыта в 1928г, принятие чистой ДНК, чистой плазмиды. Клека должна быть восприимчивой к трансформации.

Трасдукция – передача через бактериаофаги. 2-х типов: специфическая (если переносится 1 ген), неспецифическия. Коньюгация – непосредственный обмен.

 

Структура генома эукариот.

Геном отличаются от прокариот:

· Появление ядра – более сложная организация гент инф, разделение проц транскрип и трансл во времени

·. Увелич числа хромосом – со своим наобром информации. Появление Ядерного генома.

· Геном органелл – митохондрий и у раст –хлоропластов.

Структура генома хлоропластов. Консервативная часть.

Хлоропл геномпредствален 20-40 копиями отдной кольцевой молекулы. Вес 0,8-1,3 *10в8. Геном содер кодир и некодир часть. Некодир часть компактна, кодир часть рпедставл 120 непрерывн рамками считывания. Гены 4-х рибос РНК – хлоропл. 20 хром генов – белки АТФ синтазы, фотосистемы, 40 не известны. Ориждин 1. Существует несколько промоторов. Геном хлоропласта в подчинении ядерного генома. Хлоропласт бостаточно самостоятелен. Расположение генов в хлоропл докзало что их предками являя цианобактерии.

 

Геном митохондрий.

Произошли от рикеттсиоподобные бактерии, наиболее полны геном характерен баткерии рода реклиномонас. Мб. Как линейной так и кольцевой. Обе цепикодирующие для большинства организмов характерна высокая компактность генома и зависит от таксона. Выделяют 4 гр мит генома: жив, растений, грибов, простейших.

МИтхегом жив – короткая кольцеваямолекула 15-20 тыспарнукл. Четко выдел 2 части, кодирующая часть в которой плотно, перекрваясь располож 37 генов некодир – регуляторная область лил Д –петля, варьирует по длине. В ней расположены ориджин репликации, промоторы и репликаторы. Расположение генов может варьировать, добавляться некодирующие области.

Растения. Значтальено крупнее от 180-кбаз -2,5 тыс Кбаз. Набор генов сходен с набором генов жив. У растений исчезает компатная регуляторная область. Промотеры расположены по всему геному. Гены растений не перекрываются. Разделены спейсерами и могут содержват ьв себе интроны.

Грибы Длина сравнива с животными. Оомицеты(самый примитивный), низшие грибы, аскомицеты, базидиомицеты.

низшие –хитридиомицеты геном 57 кбаз, исчезает компактная регуляторная область, появля межгенные промеж до 800пн. У низших грибов появлвяются не. Аскомицеты геном мальенький, но при этом спейсеры очень длинные с промоторами, терминаторные области. Гены грибов содержат интроны 2-х типов. Интроны автосплайсинга и интроны 2 типа, которы частично экспрессируют. Высшие грибы сходны по сруктуре генома с другими грибами, происходит увеличиние генома и появляются дополнительные рамки считывания.

Мит геном простейших. Мугут быть кольцевыми и линейные – инфузория. Мол вес от 6 кбаз, до 76 тпн. Отностя геном подобный жив\гриб. Есть геномы сод – геном обла, спейсер, но промоторы распред в кодир части. В митох стр-а промотора различается, схема транскрипции различается.

2 базовые схемы транскр: позвоночных; растений и грибов.

Пунктаци теория у пзвон гены считываются по полицитрон цепи с противоположной цепитак же идет синтез единого полицистрона. Сигналом для процессинга явлчяются тРНК, котрые явл-ся «запятыми».

У раст и грибовпромоторв несколько. Считвание короткх полицистр рнк и моноцистронных рнк.

Помими базовых структур измен и промоторные.

У ляг – 2 дубл промотра, короткиею перекрваютс. У птиц влияние 2-х и обрах крестовая структура. У жив. Апстрим – регуляторный элемент. Промотор очень короткий со строгой проследовталньостьб.

У грибов ()дрожжей и нейроспоар изуч хорошо) у грибов апстрим элементы - обле посадку и инициацию, разл по длине.

Растений-3 базовых типа промотроа: промот водорослей, пром однодольных и двудольных. Однодольные – длинный, ТАТА бокс, аналог -35 элемента. У двудольн -достат длинный блок, 2 болока анлоги: ТАТА бокса и -35 бокса.

 

Струткура ядерного геном прокариато. Распол в ядре, произ несколькими хромосомами. Умэукариот больш кл диплоидные. Из-за слодности в организации и большого обема геном мб находится в состоянии-гетерохроматин, эухроматин и в состоянии митотических хромасом. Нуклеосома – оптомер из 8 гистоновых белков связь междуними обеспеч гистон Н1.

3*10в9 пн.

Соотношение кодир и некод области. У бактерий кодир 85%, у челов кодир часть 15%. Открытые рамки считывания входят в состав транскриптона. Организация транскриптонов начинает варьировать.

1 вид транскрипт- гены рибос РНК, кассета генов рибос РНК – ядрышковый организатор. Количесвто повтор копий от 100-1000. Каждая такая копия-целая единица, след транскриб полицистронная РНК.

Гены кодир белки: не распространена оперонная организация. Гены могут рапрстр наразных хром. Мозаичнаяструктура хром, интроны кодир, экзоны некодир.

рРНК и тРНК –интроновмне содержит. Длина интронов варьирует. Внутри интрона рамка считываения. Некоторые гены кластерные. гены теплового шока образ кластеры.

Некодир ДНК эукариот ориджин и репликация – значит сложнее. На 1мхром нес-ко сацтовинин репликации.

Сущ 3 типа элементов иниц транскрипции, т.к. 3 типа РНК. Нексколько паррмоторов раздел повторами сдесь е и терминаторные бобласти. Рнкполимер2 взаимоде с промторной областью, значит более крпна присусвует ТАТА боки с аналог -35 с ними связываются факторыинициации транскрипции. Регулят элемента 2 типа-апстрим регул сайт-хорошо выраж у дрожжей. Аналогичные участки металлозависимые.

 

Некодирующая часть генома – считается, что это свалка – придает массу геному. Никакой нагрузки не несет. «Свалка генома»/темная сторона генома.

Относятся: псеводегены, повторы, мобильные генетические элементы (МГЭ).

Молекулярный фингер-принт – отпечатки пальцев- используется для определения отцовства – по количеству повторов в хромосоме.

3 основные типа повторов:

· уникальные- в штучном количестве- это кодирующая часть генома

· промежуточные/среднечастотные повторы – это обычно МГЭ и псевдогены.

· Высокочастотные – это сами повторы+часть МГЭ, число в геноме до 10в6.

 

Псевдогены – нетранскрибируемы открытые рамки считывания. Результат транскрипции матричных РНК, по краям есть повторы, обеспечивающие встройку в геном. Не транскрибируются сами по себе, не содержат регуляторов транскрипции, но источник генетического разнообразия.

Частота мутаций высока: чревато. У дрозофил такое явление значительно реже. У простейших ПГ – запчасть генома, есть даже в митохондриальном геноме.

 

Высокочастотные повторы – сателитная ДНК, теломеры, центромены. Сателлиты – минорный компонент ДНК, отделяющийся от основной ДНК при равномерном ультрацентрифугированийй в граденте плотности.

Выделяют 2 основных распрееделния: дрозофилы и ксенопуса.

У ксенопусов – коротки уникальные части 50% генома и между ними тондемные повторы, по 20% редкое встраивание, и 10% -короткие повторы.

У дрозофилы 90% -одинаковый геном, длинные повторяющиеся повторы, уникальные последователньости между ними более 15 тпн.

У позвоночных распределение генома может быть 2 пердстваленных видов. Сателитная ДНК дрозофилы – образована различными повторами и оп распределению сателитной ДНК можно определить вид.

 

Сателитная ДНК по последовательности (для дорозоффилы): существует 11 семейств, 4 из них преобладаю - мажорные., 7 минорных. Часть хромосомоспецифична. Разные рамеры 6 пнк до 359 пн. Обычно сДНК накапливает мутации, но не очень быстро, но в некотрых случаях происходит изменение скорости накопления мутаций (определяются с помощью молекулярных часов).

МГЭ- селятся в сДНК.

Общее свойства:

1. Быстрая точная реассоциация, т.к. много гомологичных последовательностей

2. Простая первичная структура

3. Множество копий

4. Гомогенный состав

5. Пурин-пиримидиновая ассимитрия в распределении нуклеотидов по цепям ДНК

6. Концентрация в прицентромерном гетерохроматине

7. Ограниценная репликация при политенизации хромосом

8. Нахождение в хромосоме в ваиде тандемнорасположенных кластеров.

Содержание сДНК от 5-50%.

У позвоносных выделили 2 гр: микро(1-4тпн) и мини сателлиты. Есть еще небольшие посторы, которые образуют группу повторов с изменяющимся числом копий. Повторы с изменяющимся числом копий – VNTR.

Если критическая масса перевалена – синдром хрупкости хромосомы.

Эпигенетика – столнулись, когда начали изучать клоны.

сДНК- участвует в гетерохроматизации. Гетерохроматик транскрипц неактивная часть клетки. сДНК гетерохроматиз сама и вовлекает рядом кодирующие части.

Эффект положения – который приводит к мозаичному эффекту – разные глаза

 

Метилирование ДНК.

Происходит по метил-цитозину – входит в ЦГ островки и метелирование провоцирует гетерохроматизацию само по себе, в промоторной области происходит отключение. Метелирование- ГЦ мотив и триплет ЦНГ. Метилирование осуществляют – метилтрансферазы. Коферментом -донором является S-аденозин метионин. Склонность в метилированию отличается – у животных варьирует, у некоторых беспозвононых неметилируется, у растений может метилироваться любой цитозин, а не только входящий в опредленную группировку. У грибов – свободна от метилирвоания. Основнай масса низших эукариот –не имеет механизмов регуляции с помощью метилирования.

У эукариот метилтрансфераза около 100кДа. Метилирование напрямую выключает или стимулирует гетерохроматизацию.

Функции:

· Блокирование транскрипционного шума

· Блок транспазонов (МГЭ)

· Может блокировать кроссинговер

 

Центромера – образована повторами, некодирующая. Обнаружены при цитигенетич исследований. Перетяжка, к которой крепятся нитиверетена деления,образ кинетохор, обеспецч чивает респределение хромосом.

Центромера дрожжей сахарамицес церевизие: точечные центромеры – 125 пн: состав CDE1,2,3 – к ним препится микротрубочка. В СДЕ3 происходит прикрепление. У других дрож центромера увеличивается и образованы они сДНК.

У млекопитающих – увеличение размера центромеры, идут повторяющие элементы, альфа-сателит из 171 пн, образуя в итоге несколько млн пн. У растений центромеры могут варьировать в зависимости от хромасомы – 3 блока. Прецентромеры и центральная часть.

 

Теломеры – некодирующая часть, обнаружены цитогенетиками- концевые части хромосомы. 1932г изучают повдеение теломер. Искучтвенные конциы хромосом объединяются только с такими же искутвенно бобразвоавшимися, концевые уч-ки никогда рекомбинируют, их размер с каждым делением уменьшается.

Размер-соотв количеству делений, которые они переживут. Уменьшение происхдит из-за недорепликации концевой цепи.

Теломера состоит: повтор – теломерные повторы – участок ассоц с теломерой.

Теломерные повторы 3-4 Т/ТА и 3-4Г/С. У некоторых организмов теломеры имеют другую структуру – повторяющиеся МГЭ.

У раковых клеток происходит искусственное удлинение теломер, за счет фермента теломеразы (РНК и белок)- присоедин в недореплицир участку имея совою собственную затравку – в виде РНК.

 

Теломеры:

1.крепятся к ядерной оболочке

2. теломерные участки двух хромосом ассоциируются

3. могут взаимодействовать с гетерохроматином

Теломерные районы окрашиваются при дифферен окраске хромосом

Недореплицируются в политемных хромосомах.

Гены, располож в прителомерных участках всегда реактивируются. В результате модификации – наблюд эффект положенит.

 

Функции:

· Защита о недреплик

· Организация ДНК внутри ядра

· Доноры для репаративной рекомбинации

 

Диспергированные поторы – МГЭ и их производные, открыты в 40-х. могут премещ по геному, встраив рядом влияют на активность гена, меняют мутагенность регионов в которые встраиваются. Сами являются причиной мутагенеза.

Активирующий элемент и неавтономные элементы – состав.

МГЭ -2 типов: 1 класс- ретротранспазоны –производные ретровирусов, сод LTR элементы –перемещение в другой ген – гиперактивация или замолкание, обратная транскриптаза, GAG-белок. И 2 класс транспозоны – перемещ черехз ДНК=овую фазу.

 

У растений аналогично, но есть автономные элементы и неавтономные – перемещ при налиции автономных, которые активируют перемещение. 2 осн класса:Sine -90-400 п.о. Line

Сайн – Alu – повторы –есть 10в6 повторов. Сайн один из признаков генома млекопит.

Лайн- производны МГЭ на основе ретротранспазонов, но у них исчезают LTP-ры. L1 – 2 рамки счит, на мышах, лтр утеряны.