Введение нового (рекомбинантного) гена в клетку

Введение нового гена в клетку можно провести двумя способами: используя вектор или путем прямого введения.

Вектор — молекула ДНК или РНК, способная перено­сить включенные в нее чужеродные гены в клетку, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом (хромосомой). Не каждая молекула ДНК или РНК может быть вектором.

Векторы должны обладать определенными свойствами, в числе которых:

1. способность к автономной (т. е. независимо от хромо­сомы реципиента) репликации в клетке реципиента. На­пример, для репликации в клетке бактерии вектор должен содержать сайт ori (участок инициации репликации);

2. наличие области, в которую возможно встраивание необходимого фрагмента ДНК. Для этого вектор должен со­держать один или более участков (сайтов рестрикции), чув­ствительных к определенным рестриктазам, которые рас­щепляют вектор и позволяют встроить желаемую последо­вательность нуклеотидов (трансген);

3. небольшой размер, так как при длине более 15 т. п. н. значительно снижается эффективность клонирования чуже­родной ДНК;

4. наличие маркерных генов, позволяющих отличить трансформированные клетки от исходных. Это могут быть селективные (придающие клеткам устойчивость к антиби­отикам, гербицидам) или репортерные (клетки удобно тес­тировать по изменению окраски продуктов этих генов) гены;

5. наличие соответствующего промотора, под который необходимо поместить чужеродный ген для экспрессии в клетке бактерии.

Последовательности ДНК, расположенные перед нача­лом структурного гена и определяющие степень активности РНК-полимеразы, называются регуляторными последова­тельностями. Одна из таких последовательностей представ­ляет собой участок ДНК, с которым связывается РНК-полимераза. Этот участок называется промотором.

Регуляторные последовательности эукариотических генов отличаются от прокариотических, и бактериальная РНК- полимераза не узнаёт их. Поэтому для экспрессии эукари­отических генов в клетках прокариот нужно, чтобы гены находились под контролем бактериального промотора (т. е. промотора клетки-хозяина). В качестве промотора широко используют промотор гена, локализованного в коммерче­ских векторах, например pBR322, lac-промотор Е. coli и др.

Таким образом создается вектор, т. е. создается целая генетическая конструкция, в состав которой, помимо транс­гена, вводятся маркерные гены и соответствующие регуля­торные последовательности.

Типы векторов. В качестве векторных молекул могут служить плазмиды бактерий или дрожжей (простых эука­риотических организмов), ДНК бактериофагов или виру­сов, искусственные хромосомы дрожжей (YAK) и бакте­рий (ВАК). Созданы также гибридные (искусственные) век­торы — фазмиды, объединяющие преимущества плазмид и фагов. Для клонирования небольших фрагментов ДНК ис­пользуют плазмиды, фаговые ДНК, а для крупных — космиды и искусственные хромосомы.

1. Плазмиды. Основой для создания вектора обычно служат бактериальные плазмиды. Это небольшие внехромосомные, автономно реплицирующиеся кольцевые молекулы ДНК, которые в количестве нескольких копий содержатся в клетках бактерий. Природные плазмиды часто содержат гены, полезные для бактерий: придающие устойчивость к антибиотикам и ионам тяжелых металлов (R-плазмиды); контролирующие способность разрушать различные трудноразлагаемые токсические соединения (нафталин, камфару, толуол, ксилол, различные пестициды и др.); плазмиды биодеградации, или D-плазмиды.

Некоторые плазмиды за счет специфического сайта ини­циации репликации могут реплицироваться в клетках толь­ко одного вида бактерий; это так называемые плазмиды с уз­ким спектром хозяев. Другие плазмиды, с менее специ­фичным сайтом, могут реплицироваться в клетках разных видов бактерий; это плазмиды с широким спектром хозя­ев. Указанные особенности плазмид с успехом используют при создании векторов.

Однако есть свойства, которые не позволяют природным плазмидам выступать в качестве вектора. Так, их размер может достигать от 1 т. п. н. до 500 т. п. н., т. е. размер в большинстве случаев значительно превышает допустимый.

Кроме того, не все плазмиды несут в себе гены, которые могут служить маркерами для опознавания трансгенных клеток. Поэтому для эффективного трансгеноза приходится конструировать на основе плазмид с помощью методов ге­нетической инженерии искусственные векторные системы (плазмидные векторы). В настоящее время предложен це­лый арсенал коммерческих векторов, созданных на основе бактериальных плазмид.

Например, плазмидный вектор pBR322 создан на основе плазмиды Е. coli (рис. 4.9). Плазмида pBR322 имеет сайт ori (область, ответственную за репликацию плазмиды), ге­ны устойчивости к антибиотикам ампициллину и тетрацик­лину, причем в генах устойчивости к этим антибиотикам имеются сайты рестрикции. Если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов легко де­тектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику, так как при этом сохраняется устой­чивость к другому антибиотику. То есть вектор дает возмож­ность детектировать только те клоны бактерий, которые со­держат рекомбинантную плазмиду.

Строение векторов может быть разнообразным, но все они обязательно должны включать в себя несколько сайтов для встраивания фрагментов донорной ДНК и обеспечивать прос­тую идентификацию трансформированных клеток. В плаз­мидах можно клонировать фрагменты ДНК размером не бо­лее 10 т. п. н.

2. Вирусы — самые маленькие и самые простые из всех патогенов. Они являются одними из главных кандида­тов на роль векторов для введения чужеродной ДНК. Из них создают векторы на основе РНК, вироидоспецифичных ДНК, комбинации вироидоспецифичных ДНК с Ti-плазмидами. При вирусной инфекции каждая клетка может полу­чить большое число копий чужеродного гена. ДНК можно встраивать так, чтобы она находилась под контролем силь­ного вирусного промотора, что обеспечит высокий уровень экспрессии гена, и его продукты будут более доступны для исследования. В генетической инженерии часто используют 358-промотор вируса мозаики цветной капусты. Этот промо­тор не обладает тканевой специфичностью и активен не только в клетках крестоцветных, но и в клетках растений других семейств. Вирус должен быть жизнеспособным пос­ле рекомбинирования его ДНК. Легче всего вирусы вводят­ся в бактерии. Недостаток вирусов как векторов заключает­ся в их небольшой емкости. Кроме того, они заражают не­большой круг хозяев.

3. Челночные векторы — это плазмидные векторы, предназначенные для работы в клетках разных организмов (животных и бактерий). Чаще всего для клонирова­ния генов используют векторы с одним сайтом репликации для работы с Е. coli. При необходимости использования других бактерий или эукариотических клеток в векторы встраивают второй сайт инициации репликации, обеспечи­вающий их работу и в других клетках. Именно такие век­торные системы называются челночными. Наиболее рас­пространенные векторы состоят из плазмиды pBR322 и интактного раннего района транскрипции ДНК вируса SV40, а нужный ген встраивается под контроль промотора поз­дних генов или дополнительного раннего промотора. Чел­ночные векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток млекопитающих. Челноч­ные векторы, созданные на основе бакуловирусов для рабо­ты в клетках Е. coli и насекомых, называются бакмидами.

4. Транспозоны — это сегменты ДНК, которые контролируют собственное перемещение из одного сайта ДНК в другой путем выхода из исходного сайта и внедрения в новый сайт хромосомы или плазмиды. Впервые транспозоны были открыты в 1940-х гг. американским ученым Барбарой Мак-Клинток у кукурузы. Транспозоны как бы передвига­ются по всему геному растения. В течение многих лет ку­куруза оставалась единственной системой, в которой обна­руживались такие подвижные генетические элементы. Сейчас они выявлены у бактерий, дрозофил и других организмов.

Механизм перемещения фрагментов ДНК по геному до конца не выяснен. Поскольку подвижные гены могут пере­мещаться в пределах генома с одного места на другое, то они могут быть весьма эффективными векторами для пере­дачи рекомбинантной ДНК. Генетическая трансформация с помощью векторов на основе транспозонов была впервые осуществлена на дрозофиле. С их помощью можно перено­сить довольно крупные участки ДНК. Этот метод переноса генов имеет значительные преимущества, так как он осу­ществляется с высокой частотой и не сопровождается зна­чительными перестройками в интегрируемой ДНК.

5. Векторные системы, предназначенные для клонирования крупных фрагментов ДНК:

— космиды — векторные системы, которые объединяют в себе участки плазмидных ДНК (ген-маркер и репликон плазмиды) и ДНК бактериофага. Термин обозначает, что вектор является плазмидой, внутри которой вставлен cos- участок фага A, (cos-site), представляющий собой нукле­отидную последовательность, отвечающую за упаковку фа­говой ДНК в ее протеиновую капсулу. Космиды могут пере­носить до 40 т. п. н. клонируемой ДНК в клетки Е. coli;

I'

— фазмиды — векторы, которые также представляют со­бой искусственные гибриды между фагом и плазмидой. В за­висимости от условий, после встраивания чужеродной ДНК они могут размножаться как фаги или как плазмиды;

— бактериальная искусственная хромосома (ВАС — от англ. bacterial artificial chromosomes) — также способна переносить участки чужеродной ДНК от 150 до 300 т. п. н. Служит для трансформации животных клеток;

— дрожжевая искусственная хромосома (YAC — от англ. yeast artificial chromosomes) — сконструирована для переноса особо крупных участков чужеродной ДНК, вме­щающих фрагменты геномной ДНК длиной от 100 т. п. н. до 1 м. п. н. Для их создания к плазмиде дрожжей «пришива­ют» центромерные последовательности, теломеры, последо­вательности для автономной репликации в дрожжевой клетке, сайты рестрикции и селективные маркеры.

В качестве возможных векторов для переноса генов предполагается использовать хлоропластные и митохондри­альные ДНК.

Для идентификации трансформированных клеток, несу­щих рекомбинантную ДНК, вектор должен содержать один или несколько генов-маркеров. Выделяют две группы мар­керных генов, позволяющих отличить трансформированные клетки от исходных, — это селективные и репортерные гены:

— селективные гены — придают клеткам селективное преимущество, т. е. устойчивость к антибиотикам (канамицину, тетрациклину, неомицину и др.) или гербицидам (у растений). Основной принцип работы такого маркера — способность трансформированных клеток расти на селек­тивной питательной среде с добавкой определенных ве­ществ, ингибирующих рост и деление нетрансформированных, т. е. нормальных, клеток. Трансформанты отбирают на средах с высоким содержанием этих веществ. Например, в присутствии гена лактомазы бактериальная клетка при­обретает устойчивость к ампициллину и на среде с этим ан­тибиотиком образует клон (несущий данный ген), тогда как обычные клетки (без данного гена) на этой среде погибают;

— репортерные гены — кодируют нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях легко обнаружить. В каче­стве репортерных чаще всего используют гены (3-глюкуронидазы (uidA, другое название — gus), зеленого флюоресцент­ного белка (gfp), люциферазы (1ис), хлорамфениколацетил- трансферазы (cat). Из них в большей степени применяют гены, кодирующие белки GUS и GFP, и в меньшей — коди­рующие белки LUC и CAT.

Ген uidA (gus) является модифицированным геном из Е. coli, кодирующим Р-глюкуронидазу. Он может гидроли­зовать обширный спектр природных и синтетических глюкуронидов, что позволяет подбирать соответствующие субстра­ты для спектрофотометрического или флюориметрического определения активности фермента, а также для гистохими­ческого окрашивания тканей in situ (в синий цвет). В со­ставе химерных белков, созданных генно-инженерными ме­тодами, GUS обычно сохраняет свою функциональную ак­тивность.

GFP (green fluorescent protein — зеленый флюоресцент­ный белок) был обнаружен Т. Шимомурой и соавторами в 1962 г. у люминесцирующей медузы Aequorea victoria. Он обладает особым свойством — способен флюоресцировать в видимой (зеленой) области спектра при облучении длинно­волновым УФ. Для проявления флюоресценции не требует­ся субстратов или кофакторов. Ген gfp был клонирован в 1992 г. Г. Прашером и соавторами. Благодаря свойству бел­ка, gfp является очень перспективным репортерным геном, позволяет проводить разнообразные прижизненные (недест­руктивные) исследования с трансгенными организмами. Определяется гистохимически, по изменению окраски тка­ни при добавлении соответствующего субстрата.

Ген 1ис кодирует фермент люциферазу (клонирована из бактерий и светлячка). Люцифераза обеспечивает переход люциферинов из окисленной формы в основную, что вызы­вает свечение трансформированных клеток растений, на­капливающих этот белок.

Ген cat отвечает за синтез хлорамфениколацетилтрансферазы (выделен из Е. coli). Этот фермент катализирует реак­цию переноса ацетильной группы от ацетил-КоА к хлорамфениколу. Определяется только радиоизотопными методами.

Область применения селективных генов в основном свя­зана с простым контролем трансгеноза. Репортерные гены позволяют выявлять (по возможности количественно) времен­ные и пространственные особенности экспрессии данного конкретного гена (собственного или чужеродного). Присо­единение репортерного гена к одной лишь промоторной об­ласти позволяет исследовать в «чистом виде» ее роль в ре­гуляции экспрессии изучаемого гена на уровне транскрипции.